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Dosificación múltiple en bolo intravenoso y evaluación hemodinámica invasiva en un modelo de hipertensión de la arteria pulmonar de ratón inducida por hipoxia

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/63839
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 4,5, 4
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Vascular Surgery, The First Hospital of China Medical University, Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention, and Therapeutics of Aortic Aneurysm, 3VasoRx Inc., 4Yale Cardiovascular Research Center, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 5Department of Cell Biology, Yale University School of Medicine

Summary

Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la administración de múltiples dosis de bolo intravenoso y la monitorización hemodinámica invasiva en ratones. Los investigadores pueden utilizar este protocolo para futuras pruebas de detección de compuestos terapéuticos para la hipertensión de la arteria pulmonar.

Abstract

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad progresiva potencialmente mortal, que afecta principalmente a las pequeñas arteriolas pulmonares del pulmón. Actualmente, no existe cura para la HAP. Es importante descubrir nuevos compuestos que puedan utilizarse para tratar la HAP. El modelo de HAP inducida por hipoxia en ratones es un modelo ampliamente utilizado para la investigación de la HAP. Este modelo recapitula las manifestaciones clínicas humanas de la enfermedad de la HAP del grupo 3 y es una importante herramienta de investigación para evaluar la eficacia de nuevas terapias experimentales para la HAP. La investigación que utiliza este modelo a menudo requiere la administración de compuestos en ratones. En el caso de un compuesto que debe administrarse directamente en el torrente sanguíneo, la optimización de la administración intravenosa (IV) es una parte clave de los procedimientos experimentales. Idealmente, el sistema de inyección intravenosa debería permitir múltiples inyecciones durante un curso de tiempo establecido. Aunque el modelo de HAP inducida por hipoxia en ratones es muy popular en muchos laboratorios, es técnicamente difícil realizar múltiples dosis de bolo intravenoso y una evaluación hemodinámica invasiva en este modelo. En este protocolo, presentamos instrucciones paso a paso sobre cómo llevar a cabo la dosificación de múltiples bolos intravenosos a través de la vena yugular del ratón y realizar el cateterismo arterial y del ventrículo derecho para la evaluación hemodinámica en el modelo de HAP inducida por hipoxia en ratón.

Introduction

La hipertensión arterial pulmonar (HAP) se define por una presión sistólica media de la arteria pulmonar superior a 20 mmHg en reposo 1,2. Es una enfermedad progresiva y mortal caracterizada por una elevación sostenida de la presión arterial pulmonar, que conduce a la sobrecarga del ventrículo derecho y, finalmente, a la muerte por insuficiencia ventricular derecha1. Actualmente, no existe cura para la HAP.

El uso de modelos animales de hipertensión pulmonar es importante para probar la eficacia de las terapias experimentales para la HAP. Entre esos modelos, el modelo de HAP inducida por hipoxia en ratones ha proporcionado información clave sobre el desarrollo de la enfermedad del grupo 3 de la HAP humana 3,4. La investigación que utiliza este modelo a menudo requiere la administración de compuestos en ratones para evaluar la eficacia y seguridad del nuevo compuesto. Por lo tanto, los investigadores necesitan un procedimiento experimental detallado para la dosificación de compuestos y las mediciones hemodinámicas para garantizar la consistencia de la inyección y la reproducibilidad de la medición de la presión arterial desde el principio hasta el final.

Los métodos para la inyección intravenosa (IV) y la medición de la presión arterial han sido reportados en la literatura 5,6. Sin embargo, la metodología carece de ilustración visual y descripción detallada. Aquí ilustramos los pasos clave para una inyección intravenosa exitosa en bolo y una medición y registro precisos de la presión arterial sistémica y del ventrículo derecho. Los procedimientos presentados aquí son un recurso importante para los investigadores interesados en la vía intravenosa de la plataforma de administración de compuestos para desarrollar un tratamiento para la HAP.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo protocolos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale.

1. Preparación de animales, herramientas, equipos de medición de la presión arterial y cámara de hipoxia

  1. Aclimatación de los animales.
    NOTA: Los animales de experimentación utilizados para este estudio fueron ratones machos C57BL/6 de 8 semanas de edad con un peso de 25-27 g. Se deben considerar varios factores al estimar el número de animales necesarios para el experimento, incluida la mortalidad asociada a la cirugía, las complicaciones quirúrgicas inesperadas y la muerte súbita inesperada. Utilice al menos 10 ratones por grupo para alcanzar la potencia estadística y evitar estudios con poca potencia.
    1. Al recibirlos, aloje a los animales en jaulas ventiladas para roedores (grupos de cinco animales por jaula) provistas de ropa de cama adecuada, comida para roedores y agua. Deje que los animales se aclimaten al nuevo entorno (ciclo de luz-oscuridad de 12 h a 18-20 °C) durante al menos 3 días.
    2. Asígnelos aleatoriamente a los siguientes grupos: Normoxia (Grupo 1), hipoxia (Grupo 2) e hipoxia + 7C1/let-7 miRNA (Grupo 3).
  2. Preparación de herramientas quirúrgicas y equipos de medición de la presión arterial.
    1. Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos en autoclave (Figura 1A).
    2. Prepare una plataforma de inyección improvisada con un cono nasal de anestesia casero (Figura 1B), paquetes de sutura (Figura 1C) y equipo para el procedimiento de HAP (Figura 1D-F).
  3. Entorno experimental para la inducción de la hipertensión arterial pulmonar (HAP).
    1. Ajuste el tanque N2 , el sensor de oxígeno y la cámara de hipoxia semisellable (Figura 2A).
    2. Establezca un punto de ajuste de 10% O2 en el sensor de oxígeno y deje que el sistema alcance el estado estacionario (Figura 2B, C).
    3. Mantener los animales con hipoxia (Grupo 2) e hipoxia + 7C1/let-7 miRNA (Grupo 3) en hipoxia (10%O2) durante 3 semanas. Después de 3 semanas de hipoxia, coloque a los animales en condiciones normóxicas durante 1 semana (Figura 2D). El grupo normóxico (Grupo 1) permanece en normoxia durante 4 semanas.
      NOTA: (1) 3 semanas de hipoxia seguidas de 1 semana de normoxia es un método bien establecido para desarrollar HAP e insuficiencia cardíaca del ventrículo derecho7. El sensor de oxígeno detecta la concentración deO2 dentro de la cámara de hipoxia semisellable y la corrige mediante la infusión de gas N2 a través del tubo de infusión de gas.
    4. Inspeccione a los animales diariamente durante toda la duración del experimento (3 semanas). Consulte a un veterinario si los animales muestran signos de angustia, como pérdida de peso drástica y dificultad para respirar. Si la eutanasia es necesaria para los animales en grave peligro, excluir al animal del estudio.
      NOTA: La exposición a la hipoxia provoca la pérdida de peso corporal del ratón. Una pérdida del 10% del peso corporal se utiliza normalmente como una indicación fiable del desarrollo de HAP.
    5. Evite la apertura extensa de la cámara de hipoxia. Para la limpieza de la jaula, la reposición de alimentos, el cambio de botellas de agua y la administración de compuestos, abra las cámaras durante no más de 1 hora por semana.

2. Inyección intravenosa en bolo a través de la vena yugular

  1. Preparación y anestesia con ratones.
    1. Saque las jaulas de ratones de hipoxia (Grupo 2) e hipoxia + 7C1/let-7 miRNA (Grupo 3) de la cámara de hipoxia y retire suavemente al animal de la jaula.
      NOTA: El régimen de dosificación para 7C1/let-7 miRNA (1,5 mg/kg IV/dosis) es de dos veces por semana durante 4 semanas de tratamiento. Se recomienda que los investigadores saquen las jaulas de tratamiento de hipoxia e hipoxia + compuesto de la cámara de hipoxia durante la inyección intravenosa para asegurarse de que todos los animales reciban la misma magnitud de exposición a la hipoxia por intervalo de tiempo.
    2. Pesa el ratón con una báscula de precisión y registra su peso (Figura 3A).
    3. Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia conectada al vaporizador anestésico y ciérrela (Figura 3B). Proporcione soporte térmico y aplique lubricante ocular en ambos ojos para evitar que se seque mientras se anestesia. Exponga al ratón a isoflurano al 3% hasta que quede inconsciente (Figura 3C-D).
    4. Retira el ratón de la cámara y afeita el pelaje desde la mandíbula cranealmente hasta la mitad del esternón caudalmente. Lateralmente, afeita el pelaje desde los ángulos de la mandíbula, a través de los lados del cuello y hacia los hombros (Figura 3E).
    5. Coloque al ratón anestesiado con isoflurano en posición supina (boca arriba) en una plataforma de inyección debajo de un microscopio de disección. Mantener la anestesia a través de un cono nasal con isoflurano al 1,5% y sujetar suavemente las cuatro patas con cinta adhesiva para inmovilizar el cuerpo (Figura 3F).
    6. Aplique un estímulo nocivo (es decir, pellizcar los dedos de los pies) con pinzas rectas para asegurar un nivel adecuado de anestesia. El ratón anestesiado no debe responder a la estimulación antes y durante el procedimiento quirúrgico.
  2. Preparación del agente inyectable.
    1. Preparar un compuesto inyectable monodosis a una dosis de 1,5 mg/kg en condiciones estériles.
      NOTA: Caliente el compuesto de inyección a temperatura ambiente (RT) ya que la inyección de sustancias frías puede causar molestias y una caída en la temperatura corporal del ratón (si esto no daña el compuesto). La dosis óptima y la duración del compuesto 7C1/let-7 miRNA utilizado en este estudio se basan en publicaciones previas 8,9.
    2. Cargue la jeringa estéril de un solo uso con el volumen que se va a inyectar. Sostenga la jeringa en posición vertical y avance el émbolo para expulsar el aire de la jeringa. No reutilice la jeringa.
    3. Limitar el volumen de inyección a 200 μL en un ratón de 25 g para reducir la incidencia de hemodilución y efectos cardíacos anormales en los animales. Si se requiere un volumen mayor, divida el compuesto de inyección en dos inyecciones con un intervalo de 10 min.
  3. Prepare al ratón para la inyección intravenosa.
    1. Frote suavemente el área quirúrgica tres veces con tres rondas alternas de solución de povidona yodada y etanol al 70%. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg, SQ) 30 min antes del procedimiento quirúrgico.
    2. Haga un corte longitudinal de 0,5 cm ligeramente a la derecha de la línea media del cuello con una hoja de bisturí (Figura 3G).
    3. Use fórceps para separar el músculo y los tejidos grasos para ubicar la vena yugular externa derecha (Figura 3H).
      NOTA: Rote los sitios de inyección cada vez para evitar la formación de cicatrices.
    4. Utilice una lente de objetivo de alta potencia para permitir una fácil visualización del área de inyección (Figura 3I).
  4. Inyección intravenosa
    1. Inserte una aguja estéril de 28 G en la vena yugular con el bisel de la aguja hacia arriba (Figura 3J, K).
      NOTA: La inyección en la vena de la cola es una alternativa a la inyección en la vena yugular. Sin embargo, esta técnica es difícil de llevar a cabo mediante la administración repetida debido a la variabilidad en la profundidad de las venas, el color de la piel de la cola de los ratones y la dureza de la piel.
    2. Presione lentamente el émbolo de la jeringa para inyectar el compuesto en la vena. Deje que la aguja permanezca dentro de la vena durante 10 segundos adicionales para evitar el reflujo del inyector (Figura 3L).
      NOTA: El tinte azulado permite una fácil visualización de la inyección. No incluya el tinte cuando inyecte materiales de prueba. Una inyección inexacta provocará la acumulación de tinte azulado alrededor del sitio de inyección intravenosa.
    3. Retire la aguja y use un hisopo de algodón para aplicar presión en el sitio de la inyección para evitar el sangrado (Figura 3M).
    4. Suturar la piel con sutura 5-0 (Figura 3N). Después de la cirugía, traslade al animal a un lugar cálido, limpio y seco y proporciónele Meloxicam (1 mg/kg, SQ, q24h). Coloque al animal en una jaula de recuperación limpia sin ropa de cama, pero con el fondo cubierto con una toalla de papel.
      NOTA: El ratón debe estar despierto de la anestesia y recuperar la conciencia dentro de los 5 minutos una vez que regrese a la jaula de recuperación. Vigile el ratón en busca de signos de angustia.
    5. Regrese a los animales a su jaula de origen y vuelva a colocar la jaula del ratón en la cámara de hipoxia.
      NOTA: Todo el procedimiento, desde la anestesia de un ratón hasta la finalización de la inyección en la vena yugular, dura entre 10 y 15 minutos por un solo experimentador. Para acortar la exposición a la normoxia en ratones, se recomienda que al menos dos investigadores colaboren para llevar a cabo un procedimiento de inyección en la vena yugular.

3. Medición de la presión arterial

  1. Prepare instrumentos para medir la presión arterial.
    1. Remojar la punta del catéter de 1,0 °F en PBS precalentado a 37 °C al menos 30 minutos antes de la medición hemodinámica (Figura 4A).
    2. Mida la distancia desde el sitio de inserción del catéter hasta la ubicación deseada de la punta del catéter. Por ejemplo, la distancia entre la aorta ascendente del ratón y la mitad del cuello es de aproximadamente 1-1,2 cm. La distancia entre el ventrículo derecho del corazón y la mitad del cuello es de aproximadamente 2,3-2,8 cm.
    3. Marque dos marcas de distancia del catéter para proporcionar una indicación visual de la profundidad de inserción (Figura 4B).
    4. Conecte el catéter al transductor de presión, conecte el transductor de presión al canal de entrada 1 en el dispositivo de adquisición de datos, encienda la unidad de control de presión-volumen e inicie el software de análisis de presión arterial de adquisición de datos. Cree un nuevo documento de análisis de presión arterial y configure el canal 1 para la presión.
    5. Realice una calibración de presión de acuerdo con el protocolo del fabricante. Deje que toda la configuración se estabilice durante al menos 5 minutos (Figura 4C).
    6. En el software de análisis de la presión arterial, seleccione Conversión de unidades en el menú desplegable Canal 1 (Figura 4D, flecha roja).
    7. Establezca los valores predeterminados de conversión de unidades (Figura 4E).
      NOTA: La presión arterial se representa como milímetros de mercurio (mmHg). La salida de presión estandarizada de la unidad de control de presión es de 1 V por 100 mmHg. 25 mmHg corresponde a una salida de 0,25 V y 100 mm Hg corresponde a una salida de 1 V.
  2. Prepare el ratón para el procedimiento de medición de la presión arterial.
    1. Anestesiar al ratón con inhalación de isoflurano al 3% a través de un cono nasal.
    2. Aplique el ungüento veterinario directamente sobre la superficie ocular de los ojos del ratón para evitar la sequedad, ya que el ratón no puede cerrar los ojos bajo anestesia. Afeita el pelaje del cuello del ratón mientras estás bajo anestesia.
    3. Frote la región afeitada con tres rondas alternas de solución de povidona yodada y un hisopo de etanol al 70%. Coloque el ratón anestesiado en posición supina sobre una plataforma de inyección debajo de un microscopio de disección. Coloque la nariz del ratón en el cono de la nariz para mantener la anestesia (isoflurano al 1,5%) durante todo el procedimiento quirúrgico.
    4. Pruebe la respuesta motora del ratón anestesiado al estímulo nocivo. El ratón anestesiado no debe responder a un estímulo nocivo antes y durante la cirugía.
      NOTA: Los anestésicos inhalables (isoflurano) e inyectables (ketamina/xilacina) pueden disminuir la presión arterial. En general, la anestesia por inhalación de isoflurano tiene un ligero efecto en la reducción de la presión arterial que la ketamina/xilacina. Por lo tanto, el isoflurano es el anestésico inhalante preferido sobre la ketamina/xilacina. Lograr la profundidad adecuada de anestesia es fundamental para obtener mediciones hemodinámicas precisas y reproducibles. El investigador debe mantener constante la profundidad de la anestesia para cada ratón.
  3. Cateterismo de aorta ascendente
    1. Aplique un estímulo nocivo (es decir, pellizcar los dedos de los pies) con pinzas rectas para asegurar un nivel adecuado de anestesia. Hacer una incisión en la línea media de la piel desde la mandíbula hasta el esternón (Figura 5A).
    2. Separe las glándulas salivales y exponga la tráquea (Figura 5B).
    3. Use fórceps para limpiar el tejido blando a lo largo de los vasos para exponer la arteria carótida derecha y la vena yugular externa derecha (Figura 5C).
    4. Coloque 0,5 ml de PBS en la cavidad para retrasar el desarrollo del vasoespasmo mientras se manipula la arteria carótida.
    5. Aísle cuidadosamente una sección de 5 mm de la arteria carótida derecha. Coloque un pedazo de papel blanco estéril debajo del vaso como fondo para que la arteria sea más visible (Figura 5D).
      NOTA: Separe cuidadosamente el nervio vago (blanco) de la arteria y asegúrese de no cortar ni dañar el nervio o la arteria.
    6. Con un 8-0 sutura: haga un nudo permanente (#1) para cerrar el extremo craneal del vaso (Figura 5E).
    7. Haz un primer nudo suelto (#2) para ocluir temporalmente el flujo sanguíneo de la aorta. Luego, haga un segundo nudo suelto (#3) entre las dos primeras suturas (Figura 5F). El segundo nudo suelto (#3) se usará para asegurar rápidamente el catéter después de la colocación.
    8. Con una aguja de 25 G, haga un orificio pequeño, lo suficientemente grande como para pasar el catéter, en línea con el vaso entre las ligaduras #3 y #1 (Figura 5G).
      NOTA: Las arterias carótidas transportan sangre oxigenada desde el corazón y tienen una presión muy alta. Si se corta la arteria carótida, esa presión hará que la sangre salga a borbotones (Figura 5H).
    9. Sostenga el catéter a 1.5 pulgadas de la punta e inserte suavemente la punta del catéter a través del orificio de la arteria (marca X). Apriete el ganglio de sutura medio (#3) alrededor del catéter y el vaso sanguíneo que aún permite el paso del catéter (Figura 5I-J).
      NOTA: Este paso requiere práctica. Las posibles complicaciones de este paso incluyen sangrado en el sitio de inserción del catéter y vasoespasmo. Cuando se produce una hemorragia, la pérdida de sangre de la arteria sangrante reduce el volumen sanguíneo, lo que provoca una caída grave de la presión arterial sistémica. Debido a la gravedad, el animal ha alcanzado un punto final humanitario y debe ser sacrificado. En el caso del vasoespasmo inducido mecánicamente, suele producirse durante la inserción del catéter causada por una contracción persistente de los vasos sanguíneos. Esto hace que la abertura del vaso sanguíneo sea más pequeña y evita que el catéter avance hacia la arteria carótida. No ejerza una fuerza excesiva contra la resistencia para hacer avanzar el catéter. Cuando se encuentre una resistencia moderada o grave al vasoespasmo, inténtelo de nuevo en un rato o use un catéter más pequeño (p. ej., 1.0 F). Los microcirujanos experimentados pueden lograr tasas de éxito del 100% para el cateterismo de aorta ascendente.
    10. Después de que el catéter pase el primer nudo suelto (#2) con la punta del sensor, sujete el segundo nudo suelto (#3) con más fuerza para asegurar el catéter y suelte suavemente el primer nudo suelto (#2) (Figura 5K, izquierda).
    11. Continúe insertando el catéter hacia la aorta ascendente de acuerdo con la marca en el catéter (Figura 4B) hasta que el análisis de presión muestre un perfil de presión arterial (Figura 5M). Registre los datos de la presión arterial sistémica (PAS) utilizando el sistema de adquisición de datos y el software.
    12. Afloje el ganglio de sutura medio (#3) para permitir que se extraiga el catéter (Figura 5N).
    13. Ate el ganglio de sutura medio (#3) alrededor del vaso antes de sacar el catéter de la arteria carótida (Figura 5O-P).
    14. Coloque el catéter en PBS.
  4. Cateterismo cardíaco derecho.
    1. Aísle cuidadosamente la vena yugular externa derecha del tejido conectivo circundante y lige todas las ramas pequeñas con 8-0 sutura (puntas de flecha azules) (Figura 6A).
      NOTA: Para el cateterismo cardíaco derecho, comúnmente se accede al corazón a través de la vena yugular derecha.
    2. Con un 8-0 sutura, haga un nudo permanente (#1) para cerrar el extremo craneal del vaso (Figura 6B). Luego, haga un nudo suelto (#2) en el extremo caudal del vaso (Figura 6C).
    3. Use una aguja de 25 G para hacer un pequeño orificio proximal al nudo permanente (#1) (Figura 6D).
      NOTA: Las venas yugulares transportan sangre desoxigenada al corazón y tienen baja presión. Si se corta la vena yugular, la sangre no saldrá a borbotones (Figura 6D, E).
    4. Sostenga el catéter e insértelo en el corte de la vena (marca X) (Figura 6E) y apriete el nudo caudal (#2) alrededor del catéter y el vaso (Figura 6F).
    5. Empuje lenta y suavemente el catéter hacia el corazón derecho. Controle la profundidad de la punta del catéter en función de la marca del catéter (Figura 4B).
      NOTA: La evaluación de la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP) en ratones de tórax cerrado es un desafío debido a la compleja anatomía y estructura del VD. Este paso requiere un alto nivel de experiencia y mucha práctica. En manos de un microcirujano experimentado, la tasa de éxito del cateterismo del ventrículo derecho puede acercarse al 90%.
    6. Evalúe la posición de la punta del catéter de acuerdo con el trazado de la onda de presión en el software. Cuando la punta del catéter está en el ventrículo derecho, el monitor mostrará un trazado típico de RVSP (Figura 6G, H).
      NOTA: Cuando la forma de las curvas de presión pulmonar parece atípica (p. ej., curvas puntiagudas), esto implica una posición incorrecta del catéter. Ajuste la posición del catéter tirando suavemente del catéter un poco hacia atrás y luego avanzando lentamente el catéter a una posición más central dentro del ventrículo derecho. Para evitar la generación de artefactos en los datos de la investigación, el investigador debe evitar intentos prolongados (no más de 1 min) o repetidos (no más de dos intentos) de cateterismo del ventrículo derecho.
    7. Mantenga el catéter inmóvil y recoja los datos durante 5 min.
    8. Una vez finalizado el registro, saque con cuidado el catéter y ate el nudo caudal (#2) alrededor del vaso (Figura 6I). Vuelva a colocar el catéter en la solución de PBS.
      NOTA: Después de completar el experimento, limpie el catéter con una solución de enzimas digestivas al 1% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Además de evaluar el estado hemodinámico, los investigadores pueden extraer los corazones y los pulmones para el examen histopatológico de la HAP. Para garantizar la eficacia de la administración de múltiples bolos intravenosos, los investigadores pueden aislar las células endoteliales pulmonares y medir los niveles de miARN let-7.

4. Análisis de datos de presión arterial

  1. Examine el registro de la presión arterial.
    1. Abra el archivo de datos del software de análisis de la presión arterial (PAH JOVE.adicht).
    2. En el canal 1, seleccione un área que represente la señal de presión y coloque el cursor de forma de onda en el pico (marca X) para medir la amplitud de presión (Figura 7A).
    3. Determine la amplitud máxima de la onda de presión. Esto representa la presión sistólica (Figura 7A, flecha roja).
    4. Extraiga la región de interés (área gris de la Figura 7B ) de la imagen pulsando Mayús + Comando + 3 (para Mac) o Windows + Mayús + S (para PC con Windows) y péguela en un archivo gráfico.
  2. Análisis estadístico de los datos de presión arterial.
    1. Introduzca los datos individuales de la presión arterial del ratón en el software de análisis estadístico.
    2. Realizar una prueba t de Student no apareada para el análisis estadístico de dos grupos de estudio (normoxia vs. hipoxia; hipoxia vs. hipoxia + 7C1/let-7 miRNA). Considere las diferencias en los valores medios tan significativas como p < 0,05.

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Representative Results

La anestesia a menudo reduce la presión arterial. Por lo tanto, se utilizó una dosis mínima de anestesia para abolir los movimientos en respuesta a un estímulo nocivo. El acceso exitoso a la cámara ventricular derecha se puede visualizar a medida que la forma de onda hemodinámica cambia en diferentes regiones de los sistemas venosos (Figura 8).

En este estudio, los ratones fueron asignados aleatoriamente al grupo normóxico (21% O2) (n = 10), al grupo hipoxia (10% O2) (n = 10) o al grupo de tratamiento hipoxia + 7C1/let-7 (n = 10). Para examinar el efecto del miRNA let-7 en la supresión del desarrollo de HAP inducido por hipoxia, se administró miRNA 7C1/let-7 formulado a los ratones C57BL/6 por vía intravenosa a una dosis de 1,5 mg/kg dos veces por semana durante 4 semanas (Figura 2D).

4 semanas después de la exposición a hipoxia o normoxia, se midieron la PAS y la RVSP en un ratón de pecho cerrado. La figura 9A muestra la curva representativa de la presión arterial de los grupos de tratamiento normóxico, hipoxia o hipoxia + 7C1/let-7 miRNA. En comparación con los del grupo de control de normoxia, la RVSP aumentó significativamente en el grupo de hipoxia. Además, en comparación con el grupo de hipoxia, el tratamiento con el compuesto de miARN 7C1/let-7 en ratones dio lugar a una disminución significativa de la RVSP (Figura 9B). La PAS no varió en ninguno de los grupos, lo que es coherente con los informes anteriores7. El miARN 7C1/let-7 se dirige a las células endoteliales y disminuye la cascada de señalización de TGFβ8. Los datos muestran que 7C1/let-7 miRNA 1,5 mg/kg es altamente eficaz para reducir la presión arterial en el ventrículo derecho, lo que demuestra la eficacia de la dosis de bolo intravenoso múltiple.

Figure 1
Figura 1: Instrumentos quirúrgicos y equipos de medición de la presión arterial necesarios para los procedimientos de hipertensión arterial pulmonar. (A) Herramientas quirúrgicas utilizadas para el procedimiento de HAP. (B) Una plataforma de inyección improvisada hecha de una almohadilla absorbente envuelta alrededor de una rejilla de espuma de poliestireno de un paquete cónico de 50 ml. Colocación de un tubo de anestesia de 10 cm de longitud a la plataforma de inyección como cono nasal con tipo. (C) Paquetes de sutura. Sutura 5-0 para el cierre de la incisión y 8-0 sutura para ligadura. (D-F) Equipo de medición de la presión arterial utilizado para el procedimiento de HAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Entorno experimental para la inducción de HAP. (A) Fotografía de la configuración del sistema hipóxico BioSpherix. Se indican diferentes partes del sistema de inducción. (B-C) Sensor de oxígeno que monitoriza la concentración deO2 en la cámara de hipoxia. (D) Cronograma experimental para el tratamiento con compuestos de miARN 7C1/let-7 y exposición al nivel de oxígeno para todos los grupos de animales durante la inducción de HAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Fotografías de los pasos quirúrgicos clave para la inyección en la vena yugular. (A) Ratón en una báscula. (B) Configuración del sistema de inducción de anestesia para roedores. Se indican diferentes partes del sistema de inducción. (C-D) Imágenes de un ratón anestesiado con isoflurano en una cámara de inducción. (E) Zona quirúrgica sin pelo. (F) Un ratón colocado en una plataforma de inyección y respiró isoflurano al 1,5% a través de un cono de nariz de un vaporizador. (G) Incisión en la piel para el abordaje de la vena yugular. (H) Disección quirúrgica de la vena yugular externa derecha. (I) Imágenes de mayor aumento que muestran la vena yugular derecha aislada. Fíjate en un papel blanco debajo del vaso, lo que hace que la vena sea más visible. (J-K) Inserción de la aguja de la vena yugular derecha con el bisel hacia arriba. (L) Inyección de un compuesto con colorante azulado en la vena yugular. (M) Aplicar presión en el lugar de la inyección con un hisopo de algodón después de retirar la aguja. (N) Suturar la herida con una sutura 5-0. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Calibración del catéter. (A) Remojar la punta del catéter a 1,0 °F en PBS precalentado a 37 °C. (B) Marcas de distancia en el catéter para ayudar a estimar la profundidad de inserción del catéter en la aorta ascendente y el ventrículo derecho. (C) Equipo de medición de la presión arterial sometido a una calibración de línea de base cero. (Ca') Captura de pantalla del análisis de la presión arterial basado en software de análisis de catéter. (D) En el menú desplegable Canal 1 , seleccione el cuadro de diálogo Conversión de unidades en el software de análisis de presión arterial. (E) Ajuste de los valores predeterminados de conversión de unidades para convertir la señal de voltaje de entrada a la unidad de mmHg. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Procedimientos quirúrgicos para la medición de la presión arterial sistémica (PAS). (A) Una incisión en la línea media desde la mandíbula hasta el esternón en la piel del cuello. (B) Separación de la glándula salival para exponer la tráquea. (C) Arteria carótida derecha expuesta y vena yugular externa derecha después de la disección de tejido. (D) Una sección aislada de 5 mm de la arteria carótida. (E,F) Sutura nudo permanente en la extremidad craneal y dos nudos sueltos en la extremidad caudal. (G,H) Hacer un pequeño orificio (marca X) en la arteria carótida justo caudal al nudo permanente (#1). (I) Inserción del catéter en la arteria carótida. (J) Asegurar el catéter con un nudo de sutura medio (#3). (K,L) Soltar suavemente el primer nudo suelto (#2). (M) Ondas representativas de la presión arterial. (N) Aflojar el ganglio de sutura medio (#3). (O,P) Apriete el ganglio de sutura medio (#3) alrededor del vaso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Procedimientos quirúrgicos para la medición de la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP). (A) Ligadura de las pequeñas ramas de la vena yugular derecha (puntas de flecha azules). (B) Un nudo permanente (#1) en el extremo craneal de la vena yugular. (C) Un nudo suelto (#2) en el extremo caudal de la vena yugular. (D) Hacer un pequeño orificio en la vena yugular derecha caudal al nudo permanente (#1). (E) Inserción de un catéter en la vena yugular a través de un pequeño orificio (marca X). (F) Apretar el nudo caudal (#2) alrededor del catéter y el vaso. (G) Empujar el catéter hacia el ventrículo derecho del corazón. h) Representante RVSP. (I) Tensar el nódulo caudal (#2) alrededor del vaso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Análisis de datos del software de análisis de presión arterial después del registro. (A) Uso del cursor de forma de onda para medir la amplitud de la presión a partir de los datos brutos del software de análisis de presión arterial en el canal 1. (B) Extracción de la región de interés de la imagen de datos del software de análisis de presión arterial sin procesar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Transición de la forma de onda hemodinámica durante el cateterismo del ventrículo derecho. (A-D) Trazas representativas de los cambios de presión durante el cateterismo del ventrículo derecho de un ratón C57BL/6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Análisis de la presión arterial, figuras de representación y análisis de datos. (A) Curvas representativas de PAS y RVSP en ratones tratados con normoxia, hipoxia e hipoxia + 7C1/let-7 miRNA. (B) Gráficos resumidos de PAS y RVSP en ratones tratados con normoxia, hipoxia e hipoxia + 7C1/let-7 miRNA tratados (NS: no significativo; **p < 0,01; ***p < 0,001; prueba t de Student de dos colas no apareadas). N = 10 por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se han establecido varios modelos animales de hipertensión pulmonar para imitar los eventos de resistencia vascular pulmonar elevada en sujetos humanos. Entre ellos, el modelo de HAP inducido por hipoxia en ratones ha sido ampliamente utilizado para evaluar la eficacia de nuevas terapias experimentales para la HAP. La investigación que utiliza este modelo a menudo requiere la administración de compuestos a los ratones. En comparación con otros protocolos publicados de evaluación hemodinámica invasiva y de inyección intravenosa (IV), este método proporciona tanto una ilustración visual como una descripción detallada.

Hay tres pasos críticos para la ejecución exitosa del procedimiento y para obtener mediciones precisas y reproducibles de la presión arterial. Primero, asegúrese de que la aguja de la jeringa esté colocada correctamente en la vena yugular. La inyección incorrecta en la vena yugular puede dar lugar a una inyección subcutánea. En segundo lugar, asegúrese de que la anestesia tenga suficiente profundidad. La profundidad anestésica constante en cada ratón es importante para la generación de datos que sean comparables entre los grupos. La anestesia demasiado profunda puede causar una disminución significativa en los niveles de presión arterial. Además de la anestesia por inhalación de isoflurano, la inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina es otro método anestésico ampliamente utilizado para la cirugía con ratones. Ambos métodos tienen ventajas y desventajas. La anestesia por inhalación de isoflurano tiene varias ventajas sobre la ketamina/xilacina inyectable, que incluyen un inicio rápido, sin medicamentos controlados, una recuperación rápida y es mucho más fácil controlar la profundidad de la anestesia. Las desventajas son el costo del equipo, el olor desagradable y la exposición humana a los gases anestésicos residuales. En tercer lugar, asegúrese de que el catéter esté dentro del ventrículo derecho del corazón. Los intentos fallidos prolongados o múltiples de cateterismo del ventrículo derecho pueden causar lecturas falsas de la presión arterial.

La inyección intravenosa en ratones se administra predominantemente a través de las venas laterales de la cola. Si bien esta ruta es fácil de alcanzar con agujas, esta técnica a veces es difícil de llevar a cabo múltiples dosis de bolo intravenoso. Los dos principales desafíos en la realización de esta técnica son la variabilidad en la profundidad de la vena y la dificultad de visualización de la aguja debido al color de la piel de la cola de los ratones y la dureza de la piel. Y lo que es más importante, no hay forma de confirmar si todo el contenido de la inyección ha entrado con éxito en el torrente sanguíneo y no en los tejidos circundantes. La vena yugular es un sitio de acceso preferido porque (1) es clínicamente relevante, (2) proporciona una confirmación visual de la administración de la inyección a la vena, (3) permite múltiples inyecciones de un grupo de animales durante el curso del experimento, y (4) esta técnica de inyección es segura y el procedimiento no causa ningún efecto secundario.

Hay tres formas de registrar la presión arterial en ratones: (1) Pletismografía no invasiva del manguito de la cola10. Los sistemas permiten realizar mediciones repetidas a lo largo de un estudio longitudinal. (2) Telemetría de radio11. Los sistemas permiten la monitorización de la presión arterial en tiempo real en animales de laboratorio despiertos y que se mueven libremente. (3) Catéteres intraarteriales invasivos12. Los sistemas permiten realizar mediciones agudas de PAS y RVSP. En este protocolo, elegimos un catéter de presión para mediciones sistémicas y de presión del ventrículo derecho de alta fidelidad. Sin embargo, este método tiene algunas limitaciones. En primer lugar, el catéter de presión y el equipo de medición de la presión arterial son caros (Figura 1E-F). En segundo lugar, requiere anestesiar a los animales, esto provoca una disminución de la presión arterial. En tercer lugar, el cateterismo cardíaco derecho es un procedimiento terminal que no permite realizar mediciones seriadas. En cuarto lugar, el procedimiento no es fácil de aprender, ni siquiera por un microcirujano bien entrenado.

Una vez que se registra la presión arterial, el investigador puede aislar los corazones y los pulmones de los animales para la caracterización histológica de la HAP. Por ejemplo, mediciones del grosor de la pared del ventrículo derecho para la hipertrofia ventricular derecha y análisis del vaso distal pulmonar musculoso para la remodelación de la arteria pulmonar muscular. Los datos muestran que el miARN 7C1/let-7 es altamente efectivo para reducir la presión arterial pulmonar, lo que demuestra la efectividad de nuestra dosificación de bolo intravenoso múltiple. Además, los investigadores pueden aislar las células endoteliales pulmonares del pulmón entero recién aislado para evaluar la eficacia de los materiales inyectados.

En resumen, este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la ejecución de múltiples dosis de bolos intravenosos y la monitorización hemodinámica invasiva en un modelo de HAP inducida por hipoxia en ratones. Los investigadores pueden utilizar las técnicas de inyección en la vena yugular y cateterismo arterial/ventricular derecho descritas aquí para una amplia variedad de modelos de roedores que requieren inyección intravenosa y monitorización hemodinámica.

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Disclosures

K Zsebo, M Simons y P-Y Chen son fundadores científicos y accionistas de VasoRx, Inc. M Simons es miembro de la Junta Asesora Científica de VasoRx, Inc. HJ Duckers es empleado y accionista de VasoRx. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado, en parte, por una microbeca del Consorcio Conjunto de Biología proporcionada por el P30AR070253 de subvenciones de los NIH (PYC), el Fondo de Educación para la Investigación Médica Cardiovascular (PYC), el Fondo VasoRx, Inc. (MS) y las subvenciones de los NIH HL135582 (MS), HL152197 (MS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-0 prolene suture pack Ethicon 8698G for incision closure
8-0 nylon suture pack AROSurgical Instruments T06A08N14-13 for ligation
Anesthesia induction chamber VETEQUIP #941444 Holds the animal during anesthesia exposure
Catheter Interface Cable PEC-4D Millar for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PCU-2000
Charcoal canister filters VETEQUIP #931401  to help remove waste anesthetic gases
Cotton swabs McKesson 24-106 for applying pressure to the injection site to prevent bleeding
Fine scissors Fine Science Tools 14059-11 Surgical tools
Insulin syringe 28 G EXEL 26027 for jugular vein IV injection
Isoflurane COVETRUS #029405 for mouse anesthesia
LabChart 8 Software ADInstruments for data analysis
Mikro-Tip Pressure Catheter SPR-1000 (1.0 F) Millar for invasive blood pressure measurement
Needle-25 G BD 305124 for making a samll hole in a vessel
Oxygen controller ProOx Oxygen Sensor BioSpherix E702 for oxygen concentration monitoring
PCU-2000 Pressure Control Unit Millar for connecting Millar Mikro-Tip catheter to PowerLab 4/35
PowerLab 4/35 ADInstruments for Data Acquisition.
Investigator needs to connect the PowerLab 4/35 to a personal laptop containing LabChart 8 software for operation.
Prism 8 GraphPad for statistics and scientific graphing
Semisealable hypoxia chamber BioSpherix an artificial environment that simulates high-altitude conditions for animals
Spring Scissors Fine Science Tools 15021-15 Surgical tools
Tweezer Style 4 Electron Microscopy Sciences 0302-4-PO Surgical tools
VasoRx compound 7C1/let-7 miRNA VasoRx, Inc. Lot# B2-L-16Apr IV injection compound
VIP 3000 Veterinary Vaporizer COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. for accurate anesthesia delivery

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References

  1. McLaughlin, V. V., McGoon, M. D. Pulmonary arterial hypertension. Circulation. 114 (1), 1417-1431 (2006).
  2. Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53 (3), 1900038 (2019).
  3. Chen, Y., et al. A novel rat model of pulmonary hypertension induced by mono treatment with SU5416. Hypertension Research. 43 (8), 754-764 (2020).
  4. Xiong, M., et al. Mouse model of experimental pulmonary hypertension: Lung angiogram and right heart catheterization. Pulmonary Circulation. 11 (4), 20458940211041512 (2021).
  5. Kmiotek, E. K., Baimel, C., Gill, K. J. Methods for intravenous self administration in a mouse model. Journal of Visualized Experiments. (70), e3739 (2012).
  6. Potus, F., Martin, A. Y., Snetsinger, B., Archer, S. L. Biventricular assessment of cardiac function and pressure-volume loops by closed-chest catheterization in mice. Journal of Visualized Experiments. (160), e61088 (2020).
  7. Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary arterial hypertension. Experimental Models of Cardiovascular Diseases. 1816, 243-252 (2018).
  8. Chen, P. Y., et al. FGF regulates TGF-beta signaling and endothelial-to-mesenchymal transition via control of let-7 miRNA expression. Cell Reports. 2 (6), 1684-1696 (2012).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis. Nature Metabolism. 1 (9), 912-926 (2019).
  10. Daugherty, A., Rateri, D., Hong, L., Balakrishnan, A. Measuring blood pressure in mice using volume pressure recording, a tail-cuff method. Journal of Visualized Experiments. (27), e1291 (2009).
  11. Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. Long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
  12. Luo, F., et al. Invasive hemodynamic assessment for the right ventricular system and hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension in mice. Journal of Visualized Experiments. (152), e60090 (2019).

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Dosificación en bolo intravenoso evaluación hemodinámica invasiva modelo de hipertensión arterial pulmonar de ratón inducida por hipoxia hipertensión arterial pulmonar investigación de HAP terapias experimentales vena yugular de ratón cateterismo arterial cateterismo del ventrículo derecho modelo de HAP
Dosificación múltiple en bolo intravenoso y evaluación hemodinámica invasiva en un modelo de hipertensión de la arteria pulmonar de ratón inducida por hipoxia
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Qin, L., Jiang, B., Zsebo, K., Duckers, H. J., Simons, M., Chen, P. Y. Multiple Intravenous Bolus Dosing and Invasive Hemodynamic Assessment in a Hypoxia-Induced Mouse Pulmonary Artery Hypertension Model. J. Vis. Exp. (189), e63839, doi:10.3791/63839 (2022).

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