Методы «снизу вверх in vitro » для анализа ультраструктурной организации, изменения формы мембраны и чувствительности к кривизне септинов
Summary
Септины являются цитоскелетными белками. Они взаимодействуют с липидными мембранами и могут ощущать, но также генерировать кривизну мембраны в микронном масштабе. В этом протоколе мы описываем методологии снизу вверх in vitro для анализа деформаций мембран, чувствительного к кривизне связывания септина и ультраструктуры септиновой нити.
Abstract
Ремоделирование мембраны происходит постоянно на плазматической мембране и внутри клеточных органелл. Чтобы полностью проанализировать роль окружающей среды (ионные условия, белковые и липидные композиции, кривизна мембраны) и различных партнеров, связанных со специфическими процессами изменения формы мембраны, мы предпринимаем подходы in vitro снизу вверх. В последние годы наблюдается большой интерес к выявлению роли белков септина, связанных с основными заболеваниями. Септины являются незаменимыми и вездесущими цитоскелетными белками, которые взаимодействуют с плазматической мембраной. Они участвуют в делении клеток, подвижности клеток, нейроморфогенезе и спермиогенезе, среди других функций. Поэтому важно понять, как септины взаимодействуют и организуются на мембранах, чтобы впоследствии индуцировать деформации мембран и как они могут быть чувствительны к определенным кривизнам мембраны. Целью данной статьи является расшифровка взаимодействия между ультраструктурой септинов на молекулярном уровне и ремоделированием мембран, происходящим в микронном масштабе. С этой целью почковые дрожжи и комплексы септина млекопитающих были рекомбинантно экспрессированы и очищены. Комбинация анализов in vitro затем использовалась для анализа самосборки септинов на мембране. Поддерживаемые липидные бислои (SLB), гигантские одноламеллярные везикулы (GUV), большие одноцветные везикулы (LUV) и волнистые субстраты использовались для изучения взаимодействия между самосборкой септина, изменением формы мембраны и кривизной мембраны.
Introduction
Септины представляют собой цитоскелетные нитеобразующие белки, которые взаимодействуют с липидными мембранами. Септины повсеместно распространены у эукариот и необходимы для многочисленных клеточных функций. Они были идентифицированы как основные регуляторы деления клеток у почковых дрожжей и млекопитающих 1,2. Они участвуют в событиях изменения формы мембраны, цилиогенезе3 и спермиогенезе4. В клетках млекопитающих септины могут также взаимодействовать с актинами и микротрубочками 5,6,7 в связующем звене Rho GTPases (BORG)-зависимым способом 8. В различных тканях (нейроны9, реснички3, сперматозоиды10) септины были идентифицированы как регуляторы диффузионных барьеров для мембранно-связанных компонентов11. Было также показано, что септины регулируют образование мембран и протрузии12. Септины, являясь многозадачными белками, причастны к возникновению различных распространенных заболеваний13. Их неправильная регуляция связана с возникновением раковых заболеваний14 и нейродегенеративных заболеваний15.
В зависимости от организма несколько субъединиц септина (две у Caenorhabditis elegans до 13 у людей) собираются в комплексы, организация которых изменяется тканезависимым образом16. Основной строительный блок септина собирает от двух до четырех субъединиц, присутствующих в двух копиях и самостоятельно собранных палиндромным способом. В почковых дрожжах септины октамерны17,18. In situ септины часто локализуются на участках с кривизной микрометра; они обнаруживаются в местах сужения деления, у основания ресничек и дендритов, а также в кольце сперматозоидов19,20. На мембране роль септинов, по-видимому, двойственна: они участвуют в изменении формы липидного бислоя и в поддержании целостности мембраны21. Следовательно, исследование биофизических свойств септиновых нитеобразующих белков и/или субъединиц на мембране имеет решающее значение для понимания их роли. Для анализа специфических свойств септинов в хорошо контролируемой среде уместны подходы in vitro снизу вверх. До сих пор только несколько групп описали биофизические свойства септинов in vitro 20,22,23. Следовательно, по сравнению с другими цитоскелетными нитями, текущие знания о поведении септинов in vitro остаются ограниченными.
Этот протокол описывает, как можно проанализировать организацию нитей септина, изменение формы мембраны и чувствительность к кривизне19. С этой целью была использована комбинация методов оптической и электронной микроскопии (флуоресцентная микроскопия, криоэлектронная микроскопия [крио-ЭМ] и сканирующая электронная микроскопия [SEM]). Изменение формы мембраны гигантских одноламельных везикул (ГУВ) размером с микрометр визуализируется с помощью флуоресцентной оптической микроскопии. Анализ расположения и ультраструктуры септиновых нитей, связанных с липидными везикулами, проводится с использованием крио-ЭМ. Анализ чувствительности к кривизне септина проводится с использованием SEM, путем изучения поведения нитей септина, связанных с твердо поддерживаемыми липидными бислоями, нанесенными на волнистые субстраты переменных кривизн, что позволяет анализировать чувствительность кривизны как для положительных, так и для отрицательных кривизн. По сравнению с предыдущим анализом 20,24, здесь мы предлагаем использовать комбинацию методов для тщательного анализа того, как септины могут самособираться, синергетически деформировать мембрану и быть чувствительными к кривизне. Считается, что этот протокол полезен и адаптируется к любому нитевидному белку, который проявляет сродство к мембранам.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как указано выше, была использована липидная смесь, которая усиливает включение PI(4,5)P2 в липидный бислой и, таким образом, облегчает септин-мембранные взаимодействия. Действительно, мы показали в другом месте25 , что почковые дрожжевые септины взаимодействуют с везику?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Патрисию Бассеро и Даниэля Леви за их полезные советы и обсуждения. Эта работа была поддержана ANR (Agence Nationale de la Recherche) для финансирования проекта “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 и проекта “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin финансируется Ecole Doctorale “ED564: Physique en Ile de France” и Fondation pour lea Recherche Médicale. К. Накадзава был поддержан Университетом Сорбонны (AAP Emergence). Г.Х. Кёндеринк был поддержан Нидерландской организацией вур Ветеншаппелийк Ондерзоек (NWO/OCW) через «BaSyC-Building a Synthetic Cell». Гравитационный грант (024.003.019). Мы благодарим Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038) и Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). Мы благодарим Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA), Институт Кюри, члена Французской национальной исследовательской инфраструктуры France-BioImaging (ANR10-INBS-04).
Materials
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
| Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
| Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
| Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
| Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
| Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
| Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
| Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
| High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
| IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
| Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
| Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
| NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
| Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
| Osmometer | Löser | 15 M | |
| Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
| Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
| Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
| Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
| Wax plates, Vitrex | VWR |
References
- Finger, F. P. Reining in cytokinesis with a septin corral. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).
- Barral, Y., Kinoshita, M. Structural insights shed light onto septin assemblies and function. Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).
- Hu, Q., et al. A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution. Science. 329 (5990), 436-439 (2010).
- Lin, Y. -. H., Kuo, Y. -. C., Chiang, H. -. S., Kuo, P. -. L. The role of the septin family in spermiogenesis. Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).
- Addi, C., Bai, J., Echard, A. Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis. Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).
- Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases. Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).
- Spiliotis, E. T., Nakos, K. Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins. Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).
- Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules. Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).
- Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks. PloS One. 9 (12), 113916 (2014).
- Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain. The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).
- Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth. The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).
- Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -. C. M., Krummel, M. F. The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing. The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).
- Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. Septin functions in organ system physiology and pathology. Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).
- Angelis, D., Spiliotis, E. T. Septin mutations in human cancers. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122 (2016).
- Takehashi, M., et al. Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer’s disease. Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).
- Shuman, B., Momany, M. Septins from protists to people. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850 (2022).
- Bertin, A., et al. Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).
- Iv, F., et al. Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Journal of cell science. 134 (15), (2021).
- Beber, A., et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Patzig, J., et al. Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction. eLife. 5, 17119 (2016).
- Szuba, A., et al. Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins. eLife. 10, 63349 (2021).
- Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes. Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).
- Bertin, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization. Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).
- Beber, A., et al. Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles. Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation. Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).
- Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling. Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells. Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).
- Franck, A., et al. Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle. Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).
- Elkhatib, N., et al. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. 356 (6343), (2017).
- Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM. Journal of Microscopy. 189, 79-89 (1998).
