ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים. הם מתקשרים עם ממברנות שומנים ויכולים לחוש אך גם ליצור עקמומיות ממברנה בקנה מידה של מיקרון. אנו מתארים בפרוטוקול זה מתודולוגיות in vitro מלמטה למעלה לניתוח עיוותים של ממברנות, קשירת ספטין רגישה לעקמומיות ואולטרה-מבנה של נימה ספטין.
שיפוץ ממברנה מתרחש כל הזמן בקרום הפלזמה ובתוך אברוני התאים. כדי לנתח באופן מלא את תפקיד הסביבה (תנאים יוניים, הרכבי חלבונים ושומנים, עקמומיות הממברנה) ואת השותפים השונים הקשורים לתהליכי עיצוב מחדש של ממברנה ספציפיים, אנו נוקטים בגישות מלמטה למעלה במבחנה . בשנים האחרונות יש עניין רב בחשיפת תפקידם של חלבוני ספטין הקשורים למחלות גדולות. ספטינים הם חלבונים ציטוסקטליים חיוניים הנמצאים בכל מקום ומקיימים אינטראקציה עם קרום הפלזמה. הם מעורבים בחלוקת תאים, תנועתיות תאים, נוירו-מורפוגנזה, וזרעונים, בין תפקידים אחרים. לכן, חשוב להבין כיצד ספטינים מתקשרים ומתארגנים בממברנות כדי לגרום לאחר מכן לעיוותים של הממברנות וכיצד הם יכולים להיות רגישים לעקמומיות ממברנה ספציפית. מאמר זה נועד לפענח את יחסי הגומלין בין המבנה האולטרה-מבנה של ספטינים ברמה המולקולרית לבין שיפוץ הממברנה המתרחש בקנה מידה מיקרוני. לשם כך, שמרים ניצנים, ומתחמי ספטין של יונקים באו לידי ביטוי וטוהרו באופן רקומביננטי. לאחר מכן נעשה שימוש בשילוב של בדיקות חוץ גופיות כדי לנתח את ההרכבה העצמית של מחיצות בממברנה. דו-שכבתי שומנים נתמכים (SLBs), שלפוחיות חד-לשוניות ענקיות (GUVs), שלפוחיות חד-לשוניות גדולות (LUVs) ומצעים גליים שימשו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין הרכבה עצמית של ספטין, עיצוב מחדש של הממברנה ועקמומיות הממברנה.
ספטינים הם חלבונים יוצרי חוטים ציטוסקטליים המקיימים אינטראקציה עם ממברנות שומנים. ספטינים נמצאים בכל מקום באאוקריוטים וחיוניים לתפקודים תאיים רבים. הם זוהו כמווסתים העיקריים של חלוקת תאים בשמרים ניצנים ויונקים 1,2. הם מעורבים באירועי עיצוב מחדש של הממברנות, ciliogenesis3, ו spermiogenesis4. בתוך תאי יונקים, ספטינים יכולים גם לקיים אינטראקציה עם אקטין ומיקרוטובולים 5,6,7 בקלסר של Rho GTPases (BORG) תלוי-אופן8. ברקמות שונות (נוירונים9, ריסונים3, זרעונים10), ספטינים זוהו כמווסתים של מחסומי דיפוזיה עבור רכיבים הקשורים לממברנה11. כמו כן, הודגם כי ספטינים מווסתים את התפוררות הממברנה ואת היווצרות הבליטה12. ספטינים, בהיותם חלבונים רב-משימתיים, מעורבים בהופעתן של מחלות שכיחות שונות13. הטעות שלהם קשורה להופעת סרטן14 ומחלות נוירודגנרטיביות15.
בהתאם לאורגניזם, כמה תת-יחידות ספטין (שתיים ב– Caenorhabditis elegans עד 13 בבני אדם) מתכנסות ליצירת קומפלקסים שארגונם משתנה באופן תלוי רקמות16. אבן הבניין הבסיסית של ספטין אוספת שתיים עד ארבע יחידות משנה, הקיימות בשני עותקים ומורכבות באופן פלינדרומי דמוי מוט. בשמרים ניצנים, ספטינים הם אוקטאמריים17,18. באתרו, מחיצות ממוקמות לעתים קרובות באתרים עם עקמומיות מיקרומטר; הם נמצאים באתרי התכווצות החטיבה, בבסיס הריסונים והדנדריטים, ובטבעות של זרעונים19,20. בממברנה, תפקידם של המחיצות נראה כפול: הם מעורבים בעיצוב מחדש של דו-שכבת השומנים ובשמירה על שלמות הממברנה21. לפיכך, חקירת התכונות הביופיזיות של חלבונים יוצרי נימה ספטין ו/או תת-יחידות בממברנה היא חיונית להבנת תפקידם. כדי לנתח תכונות ספציפיות של ספטינים בסביבה מבוקרת היטב, גישות מלמטה למעלה במבחנה מתאימות. עד כה, רק קבוצות מעטות תיארו את התכונות הביופיזיות של ספטינים במבחנה20,22,23. לפיכך, בהשוואה לחוטים ציטוסקטליים אחרים, הידע הנוכחי על התנהגות ספטינים במבחנה נותר מוגבל.
פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לנתח את הארגון של חוטי ספטין, עיצוב מחדש של הממברנה ורגישות לעקמומיות19. לשם כך נעשה שימוש בשילוב של שיטות מיקרוסקופיה אופטית ומיקרוסקופיית אלקטרונים (מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים [cryo-EM], ומיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת [SEM]). עיצוב מחדש של הממברנה של שלפוחיות חד-מיות ענקיות בגודל מיקרומטר (GUVs) ממחיש באמצעות מיקרוסקופיה אופטית פלואורסצנטית. ניתוח הסידור והאולטרה-מבנה של חוטי ספטין הקשורים לשלפוחיות שומנים מבוצע באמצעות cryo-EM. ניתוח רגישות עקמומיות ספטין מתבצע באמצעות SEM, על ידי לימוד ההתנהגות של חוטי ספטין הקשורים לדו-שכבתיות שומנים נתמכות מוצקות המופקדות על מצעים גליים של עקמומיות משתנה, המאפשרת ניתוח רגישות לעקמומיות עבור עקמומיות חיובית ושלילית כאחד. בהשוואה לניתוח הקודם20,24, כאן, אנו מציעים להשתמש בשילוב של שיטות כדי לנתח ביסודיות כיצד ספטינים יכולים להרכיב את עצמם, לעוות באופן סינרגטי את הממברנה ולהיות רגישים לעקמומיות. פרוטוקול זה הוא האמין להיות שימושי וניתן להתאמה לכל חלבון נימה המציג זיקה לממברנות.
כאמור, נעשה שימוש בתערובת שומנים המשפרת את שילוב PI(4,5)P2 בתוך דו-שכבת השומנים ובכך מקלה על אינטראקציות בין ממברנת ספטין. ואכן, הראינו במקומות אחרים25 כי מחיצות שמרים ניצנים אינטראקציה עם שלפוחית באופן ספציפי PI(4,5)P2. הרכב שומנים זה הותאם אמפירית מסינון יצירות מרובות וכ…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לפטרישיה בסראו ודניאל לוי על העצות והדיונים המועילים שלהם. עבודה זו נהנתה מתמיכת ANR (הסוכנות הלאומית דה לה רשרש) למימון הפרויקט “SEPTIME”, ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014, והפרויקט “SEPTSCORT”, ANR-20-CE11-0014-01. B. Chauvin ממומן על ידי אקול דוקטורלה “ED564: Physique en Ile de France” ו- Fondation pour lea Recherche Médicale. K. Nakazawa נתמך על ידי אוניברסיטת סורבון (AAP Emergence). G.H. Koenderink נתמך על ידי ארגון Nederlandse voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW) באמצעות ‘BaSyC-בניית תא סינתטי’. מענק כבידה (024.003.019). אנו מודים לסולם התאים של Labex (n) (ANR-11-LABX0038) ולפריז Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02). אנו מודים להדמיית תאים ורקמות (PICT-IBiSA), מכון קירי, חבר בתשתית המחקר הלאומית הצרפתית צרפת-ביו-דימות (ANR10-INBS-04).
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
Bath sonicator | Elma | Elmasonic S10H | |
Bodipy-TR-Ceramide | invitrogen, Thermo Fischer scientific | 11504726 | |
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol | Sigma Aldrich | ||
Confocal microscope | nikon | spinning disk or confocal | |
Critical point dryer | Leica microsystems | CPD300 | |
Deionized water generator | MilliQ | F1CA38083B | MilliQ integral 3 |
Egg L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051 | |
Field Emission Gun SEM (FESEM) | Carl Zeiss | Gemini SEM500 | |
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution | Thermo Fischer scientific | 50-262-19 | |
High vacuum grease, Dow corning | VWR | ||
IMOD software | https://bio3d.colorado.edu/imod/ | software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction | |
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids | Eloise | 01883-F | |
Lipids | Avanti Polar Lipids | ||
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046 | |
Metal evaporator | Leica microsystems | EM ACE600 | |
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81 | Norland Products | NOA71, NOA81 | |
Osmium tetraoxyde 4% | delta microscopies | 19170 | |
Osmometer | Löser | 15 M | |
Plasma cleaner | Alcatel | pascal 2005 SD | |
Plasma generator | Electron Microscopy Science | ||
Plunge freezing equipment | leica microsystems | EMGP | |
Transmission electron microscope | Thermofischer | Tecnai G2 200 kV, LaB6 | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22451 | this product is not available for purchase any longer |
Wax plates, Vitrex | VWR |