本协议描述了使用Tomo5的高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集以及使用emClarity的后续数据处理和子断层图平均。以载铁蛋白为例,说明实现 2.86 Å 分辨率冷冻电子断层扫描结构的详细分步过程。
冷冻电子断层扫描(cryo-ET)近年来发展势头强劲,特别是自从引入直接电子探测器,改进的自动采集策略,扩展电子显微镜使用冷冻电子断层扫描进行高分辨率成像的可能性的制备技术以及新的断层图平均软件以来。此外,数据采集变得越来越简化,使许多用户更容易访问。SARS-CoV-2 大流行进一步加速了全球许多设施的远程冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 数据收集,尤其是单颗粒冷冻电镜,使用户在大流行期间能够不间断地访问最先进的仪器。随着Tomo5(3D电子断层扫描软件)的最新进展,远程冷冻电子断层扫描数据收集已变得强大且易于从世界任何地方处理。本文旨在提供详细的演练,从断层扫描软件中的数据收集设置开始,用于(远程)冷冻电子断层扫描数据收集会话的过程,并进行详细的故障排除。(远程)数据收集协议进一步补充了以apoferritin为例,通过emClarity的亚断层图平均,以近原子分辨率进行结构测定的工作流程。
众所周知,低温电子显微镜(cryo-EM)经历了一个复兴时期,加速了它成为结构生物学的核心和中心有用的工具。直接电子探测器1,2,3的开发与利用,改进的显微镜和电子源3,4,5,自动化/吞吐量的改进6,7,8,9,以及单颗粒分析的计算进展10,11,12,13,14和断层扫描15,16,17都是该技术最近成功的部分原因。这些技术驱动因素已经发展了冷冻电镜在低温和天然条件下解决生物大分子结构的能力。容易获得的分辨率足以进行原子精确的建模,并将该技术带到结构生物学领域的最前沿。表达和纯化目标生物靶标的还原论方法早已在基础生物学研究、药物发现和转化科学的大分子晶体学 (MX) 中被证明是成功的。以同样的方法,冷冻电镜现在可以提供与高分辨率MX研究平行的结果。目前在结构生物学的冷冻电镜分支中取得的主要成功称为单颗粒分析(SPA),它获取通常纯化蛋白质标本18的2D投影图像,以获得生物大分子19的数千个视图。这些图像 (1) 包含来自一系列视图的信息,这些信息完全代表了 3D 空间中目标的方向,以及 (2) 捕获物体构象异质性,以后可以对其进行分离和研究。
另一种获取生物样品的2D投影图像的方法是冷冻电子断层扫描(cryo-ET),即使是 原位 且未经纯化。冷冻电子断层扫描通过机械旋转标本,以倾斜角度拍摄同一物体的一系列图像。因此,在SPA中收集的2D投影,代表目标分子的角度姿势,本质上是作为冷冻电子断层扫描成像实验20的一部分收集的。然后将断层倾斜系列重建为断层图,其中包含成像大分子复合物的 3D 表示。断层扫描数据收集的性质在一定程度上确实减少了对平均的依赖,以实现从 2D 图像集合中实现分子的完整 3D 表示。然而,由于当前的载物台设计,试样通常从-60°倾斜到+60°,在断层扫描3D重建中留下缺失的楔形21 信息。
然后,单个断层图中的3D重建具有缺失的信息楔形和低信噪比。可以将单个大分子提取为断层图下图,并平均在一起以解决此问题。如果子断层图中的每个大分子以不同的方向找到,则在目标对象的每个子断层图中,缺失的楔形图的方向不同,因此由于缺少楔形,对许多副本进行平均会填充信息。图像处理的最新发展也试图训练人工智能神经网络,用有意义的数据填补缺失的楔子22。这种平均过程还增加了信噪比,类似于单颗粒分析中的平均目标,因此重建的质量和分辨率得到了提高。如果感兴趣的分子具有对称性,也可以在平均过程中定义和使用,从而进一步提高重建分辨率。将大分子的 3D 体积从断层图提取到一组子断层图及其后续处理中称为断层图平均 (STA)23。如果每个断层扫描代表正在研究的分子的唯一副本,则可以使用STA工作流程询问任何结构异质性。正如SPA工作流程中常用的那样,在STA期间可以采用分类技术来剖析感兴趣的复合物的构象状态。除了STA能够在冷冻电子断层扫描中实现高分辨率重建外,这种方法使该技术成为研究天然细胞环境中大分子结构机制或通常不适合SPA24,25,26的靶标的有力工具。
电子断层扫描在室温下确定细胞标本的3D超微结构方面有着悠久的历史27。通过标本的物理倾斜获取视图为在细胞长度尺度上对物体进行 3D 重建提供了足够的信息,当细胞结构缺乏平均的规律性时尤其重要。细胞也可以冷冻到基板上,以便在细胞边缘进行冷冻电子断层扫描成像,其中标本足够薄以透明电子。在这些条件下,STA可用于确定细胞环境中的大分子结构,尽管当样品足够薄以达到电子透明时28。然而,当与其他制备技术相结合时,包括冷冻相关光学和电子显微镜(cryo-光电联用显微)和聚焦离子束铣削(cryo-FIB),冷冻电子断层扫描可用于在低温条件下对整个细胞内部进行成像29。这将冷冻电子断层扫描研究细胞超微结构的能力与STA的力量相结合,原 位 确定大分子复合物的结构,同时识别其细胞位置30 并提供参与动态过程的复合物的快照31。该技术对细胞标本进行成像并在多项研究中采用STA的能力突出了该技术在 原位 解决大分子结构的能力,即使在与SPA32相当的分辨率下也是如此。另一个好处是了解大分子的原始位置,由断层图30中的最终分类3D重建表示。因此,大分子结构可以与细胞超微结构相关。这些跨长度尺度的观察可能会导致重要的发现,其中结构机制可能与功能研究中的细胞变化相关。
冷冻电子断层扫描和 STA 允许在三个主要工作流程中收集数据:分子、细胞和薄片断层扫描。纯化的大分子复合物的结构可以通过分子断层扫描通过冷冻断层扫描来确定。在细胞足够薄的细胞环境中确定蛋白质结构可描述为细胞断层扫描。最近,随着低温靶向和铣削的发展,这些相同的技术可以应用于薄片断层扫描工作流程,以确定细胞深处天然环境中的蛋白质结构,同时揭示观察到这些蛋白质的细胞环境。根据可用的软件包,最重要的是,可以根据样品的要求使用不同的数据收集策略。纯化蛋白质的铜 TEM 网格上的分子或非贴壁样品通常需要较少的处理,因此在理想情况下保持平坦且未损坏。电子断层扫描可以很容易地在孔碳网格上串联设置,以系统的方式快速获取数十到数百个断层图。用户设置蛋白质大量存在于网格上的分子断层扫描样品的最简单方法是使用Tomo5(本研究中使用的3D电子断层扫描软件,见材料表)。其他断层扫描软件,如 Leginon9 和 serialEM6 也可用;它们为更个性化的数据收集方法提供了更多的设置选项,但更复杂,因此更难导航,特别是对于刚接触断层扫描的用户和远程访问其会话的用户。对于拥有庞大而多样化的用户群的设施,Tomo5易于在远程环境中操作并培训用户。对于贴壁细胞,网格通常需要更多的处理步骤,并且使用易碎的金网格的必要性增加了在处理和数据收集策略中改进护理的需求。为了便于找到感兴趣的蜂窝区域并避免在高倾斜角度下被网格本身遮挡,使用更大的网格尺寸也是有益的,但代价是它们本质上更脆弱。对于薄片样品,样品的脆性由薄片的质量决定,这可能是可变的。这些因素增加了设置时间和考虑因素,但增加的适应性和鲁棒性再次使Tomo5适合这种类型的数据收集。但是,每个工作流都存在专门的数据收集方案。BISECT和PACE-tomo(均在SerialEM中运行)引入了在断层扫描采集过程中脚本化光束图像偏移的可能性,以提高断层扫描收集速度28,特别是在分子断层扫描中。SerialEM6,7,33中的中放大倍率蒙太奇(MMM)可以更好地识别和精确靶向所有工作流程中的分子特征,尽管在撰写本文时,这些功能已开始在Tomo5中实现。
与SPA一样,通过对采集软件的改进以及用于平均16,17,32,34,35,36,37,38的子断层图的大量可用软件包,冷冻电子断层扫描和STA变得越来越容易获得。此外,在大流行期间,能够远程访问冷冻电镜仪器对于英国钻石光源 (DLS) 的电子生物成像中心 (eBIC) 等国家设施的持续运营至关重要。这些发展使冷冻电子断层扫描对于希望利用该技术的研究人员来说更容易获得和强大。一旦获得数据,STA是分析循环对象以获得最大分辨率重建并允许对大分子异质性进行分类的重要工具。目前的协议旨在提供准备冷冻透射电镜显微镜以进行冷冻电子断层扫描数据收集的详细演练,以及如何使用emClarity对载铁蛋白的分子断层扫描数据集作为示例进行断层图平均。使用 emClarity(用于高分辨率冷冻电子断层扫描和亚断层扫描平均的软件,参见材料表)需要从命令行运行脚本,因此假定对 Linux/UNIX 系统有一定程度的熟悉。
远程连接取决于每个研究所/设施的网络环境。在 eBIC,远程系统使用允许在 Diamond 使用的特定网络配置上进行远程数据收集的程序。与显微镜的远程连接可通过两个平台实现:NoMachine和TeamViewer(参见 材料表)。使用程序NoMachine,用户可以登录到远程Windows桌面。NoMachine提供的远程Windows桌面与显微镜位于同一网络上,因此充当显微镜的虚拟支持PC。用户通过虚拟支持PC连接到显微镜,通过TeamViewer直接访问和控制运行TUI和Tomo的显微镜PC。
本协议由两部分组成(步骤1和步骤2)。第 1 步侧重于使用 Tomo5(3D 电子断层扫描软件)进行远程冷冻电子断层扫描数据采集。(远程)会话的演练以越来越高的放大倍率捕获图像,最终允许用户将断层扫描软件引导到标本区域进行断层扫描数据收集。 图 1 总结了此过程。第 2 步详细介绍了使用 emClarity(高分辨率冷冻电子断层扫描和亚断层图平均软件)进行冷冻电子断层扫描 STA 数据处理。 图 9 总结了此过程。
该协议适用于远程受众。它假设人员在显微镜下并加载样品已完成直接对准,并负责相机调整和增益参考获取。对于该协议,假设使用带有自动加载器的三聚光镜系统。有关断层扫描软件的进一步详细指南,可在加载软件的 Windows 开始按钮中找到制造商的详细手册。
托莫5
断层扫描软件的工作流程描述重点介绍了(远程)批量断层扫描会话设置的一种潜在且最简化的方法。虽然该软件对初学者来说很容易,但一些初步的冷冻电镜经验和基本的断层扫描理解可以帮助进行设置。协议中突出显示了关键步骤,即使使用了不同的设置方法,也应有助于排除故障。该软件的进步将简化(远程)数据收集,并使冷冻电子断层扫描更容易被广泛的用户群使用。下面介绍了一些有助于解决常见问题的提示和技巧。
要讨论的一个重要点是网格的选择,因为当将试样倾斜到±60°时,高倾斜的网格条会遮挡视线(图8)。在TEM网格上,网格大小是指网格每单位长度的网格正方形数。网格数越大,每单位长度的网格正方形越多,网格正方形的密度越高,网格正方形越小,即 400 目网格的正方形比 200 目网格小。断层扫描网格的不错选择是 200 目或 300 目网格。 如图 8 所示,随着网格的倾斜,要收集的可用区域会减少。在±60°倾斜时,300目网格将具有一个小视野,可以在其上获取完整的断层扫描。200目网格的优点是较大的网格正方形使分子断层扫描设置更快,并且随着网格平方面积的增加,一个网格可能足以过夜收集。缺点是 200 目网格更脆弱,因此处理和裁剪需要更多的技巧。
此外,如果在EM网格上使用多孔支撑膜(见 材料表),则必须考虑孔间距,以设置相对于曝光区域的焦点和跟踪区域。理想情况下,所需放大倍率下的光束直径应足够小,以覆盖沿倾斜轴与曝光区域相邻的碳区域,以实现最佳和快速设置。这样,就可以获取每个孔中潜在的感兴趣区域。
由于软件的真心高度例程目前不那么强大,例如 serialEM 例程,以下提示可以解决此问题。如果使用真心高度预设确定真心高度失败,则可以改用概览预设并重新运行“通过载物台倾斜自动同心”;如果以心为中心的高度远离 0,这可以解决问题。如果成功,则可以使用“真心高度”预设重新运行“通过载物台倾斜自动真心”以提高精度。如果失败,可以使用预设的真心高度运行“通过光束倾斜自动同心”,然后重新运行“通过载物台倾斜自动同心”,或者在TEM用户界面的“载物台”设置下手动设置通过“通过光束倾斜自动同心”合并的z高度。如果使用具有重复孔模式的网格,它们可能会阻止识别单个互相关峰。可以尝试将真心高度预设更改为较低的离焦偏移,例如-25μm和/或更短的曝光时间,以减少空穴图案的互相关。另一方面,使用蕾丝网格/薄片可能无法为强互相关峰提供足够的信号。可以尝试将真心高度预设更改为更大的离焦偏移,例如-75μm和/或延长曝光时间,以增强互相关峰。另一种选择是调整图像过滤器设置;它们可以在“准备”选项卡中找到。可以针对低(概览/网格平方)、中(共中心高度)和高放大倍率(跟踪/聚焦)设置调整滤镜设置的选项,以找到每个预设的最佳互相关峰值。所需的输入是一个图像,即 0° 和 5° 处,然后单击 比较 以比较两个图像。最长波长的推荐起始值为影像中比例尺的四分之一,最短波长的起始值为比例尺的四十分之一。如果峰不能可靠地确定,则可以优化设置,直到找到令人信服的峰。无需每次都重新获取图像;只需按“比较”就足够了。如果TOMO仍然无法自动找到真心高度,则可以使用手动共心高度校准。应该在“准备”选项卡中以概览放大倍率居中相当大的冰晶,然后转到TEM用户界面的“载物台控制”,将alpha设置为-30°,并调整载物台z值以使用荧光屏图像重新居中晶体。在TEM用户界面中选择“高分辨率”和“高对比度”设置将使这变得简单(荧光屏幕窗口底部的按钮)。或者,如果可以访问具有实时模式的相机,则可用于确定真心高度;这将比荧光屏上更容易。
5.8 之前的 Tomo5 版本的最大限制是缺少中等放大倍率蒙太奇、缺少剂量对称方案以及与真心高度查找相关的问题。这些存在于 serialEM 中,这是一个具有快速开发和社区支持的免费软件,一个强大的以心为中心的高度程序,以及脚本选项,即定制的剂量对称方案。从 Tomo5 的 5.8 版本开始,通过实现设置共心高度接受标准的选项,解决了查找真心高度时最常遇到的问题,即围绕目标 z 值循环失败。但是,对于不同的网格和样品类型,强烈建议调整图像过滤器设置,以反映各个会话的独特成像条件,并提供最佳的互相关峰,以找到真心高度,并使焦点和跟踪区域在断层扫描采集期间可靠地工作。
总体而言,许多设施在大流行期间已迅速适应远程操作。Tomo5软件提供了一种易于访问和用户友好的断层扫描途径,非常适合远程操作。软件的进步无疑将继续使远程数据收集和断层扫描收集在社区中更加主流。
清晰
由于emClarity使用基于模板的粒子拾取方法,因此它需要感兴趣对象的模板。颗粒拾取(步骤2.6)非常敏感,是最终结构的关键。在平均和对齐(步骤 2.9)之前,必须确保仔细检查并手动删除误报。当模板不可用时,emClarity 可能不容易使用,但可以使用其他软件(例如 Dynamo37 和 PEET48)来创建初始模型。
对于异构样品,emClarity 配备了一种分类方法,使用户能够专注于不同尺度的特定特征。在分类之前运行几个对齐周期并在更高的分箱(例如箱 4 或箱 3)下运行它会很有帮助。
与第一个版本(V1.0)相比,该软件的最新版本(V1.5.3.11)进行了重大更新17。这些包括但不限于CTF估计期间的偏手性检查(步骤2.3);对齐对称性(CX、I、I2、O);计算每个粒子的3D采样函数(3DSF);切换到 MATLAB 2019a 以实现兼容性和稳定性;以及使用原始投影图像 (CISTEM) 进行重建。该软件将继续针对各种样品进行改进,最新的公告可以在线找到(见 材料表)。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢钻石光源访问和支持英国国家电子生物成像中心(eBIC)的冷冻电镜设施,该中心由威康信托基金会,MRC和BBRSC资助。我们还要感谢Andrew Howe收购了Apoferritin断层扫描(电影1),Ishika Kumar准备和获取了神经元断层扫描(电影2),以及Craig MacGregor-Chatwin的蓝藻层断层扫描(电影3)。
Software | |||
Tomography | Thermo Fisher Scientific | 5.9.0 | Internal terminology: Tomo5 in document |
TEM server | Thermo Fisher Scientific | 7.10.1 | |
TIA | Thermo Fisher Scientific | 5.10.1 | |
DigitalMicrograph | Gatan | 3.44 | |
emClarity | Open-Source software | 1.5.3.11 | Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging |
IMOD | Open-Source software | 4.11 | Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data |
MotionCor2 | Free for academic use | 1.1.0 | A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded on dose fractionated movie stacks |
ETomo | Open-Source software | 4.11 | ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. |
NoMachine | NoMachine, freeware | 7.9.2 | Remote desktop software |
TeamViewer | TeamViewer AG | – | Remote access and remote control computer software |
Materials | |||
Quantifoil (holey support film) EM grids | Quantifoil | – | A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement |
Instrumentation | |||
Titan Krios microscope | Thermo Fisher Scientific | Titan Krios G2 | |
K3 camera and GIB energy filter | Gatan | – | |
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | – | |
Website | |||
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ | – | – | Link to download the emClarity software package |
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ | – | – | Link to download IMOD |
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial | – | – | Link to the emClarity online tutorial |
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | – | – | Link to download MotionCor2 |
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki | – | – | Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity |