Den nuværende protokol beskriver højopløsnings kryo-elektrontomografi fjerndataindsamling ved hjælp af Tomo5 og efterfølgende databehandling og subtomogram gennemsnit ved hjælp af emClarity. Apoferritin bruges som et eksempel til at illustrere detaljerede trin-for-trin processer for at opnå en cryo-ET-struktur ved 2,86 Å opløsning.
Cryo-elektrontomografi (cryo-ET) har fået fart i de senere år, især siden introduktionen af direkte elektrondetektorer, forbedrede automatiserede erhvervelsesstrategier, forberedende teknikker, der udvider mulighederne for, hvad elektronmikroskopet kan afbilde i høj opløsning ved hjælp af cryo-ET og ny subtomogram gennemsnitssoftware. Derudover er dataindsamling blevet mere og mere strømlinet, hvilket gør det mere tilgængeligt for mange brugere. SARS-CoV-2-pandemien har yderligere fremskyndet indsamling af eksterne kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), især for enkeltpartikel cryo-EM, i mange faciliteter globalt, hvilket giver uafbrudt brugeradgang til avancerede instrumenter under pandemien. Med de seneste fremskridt inden for Tomo5 (software til 3D-elektrontomografi) er fjernindsamling af cryo-ET-data blevet robust og nem at håndtere fra hvor som helst i verden. Denne artikel har til formål at give en detaljeret gennemgang, startende fra dataindsamlingsopsætningen i tomografisoftwaren til processen med en (fjern) cryo-ET-dataindsamlingssession med detaljeret fejlfinding. Den (fjerntliggende) dataindsamlingsprotokol suppleres yderligere med arbejdsgangen til strukturbestemmelse ved nær-atomopløsning ved subtomogram gennemsnit med emClarity ved hjælp af apoferritin som et eksempel.
Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er almindeligt kendt for at have oplevet en renæssanceperiode, der fremskynder den til at blive et centralt og centralt nyttigt værktøj i strukturel biologi. Udvikling og udnyttelse af direkte elektrondetektorer 1,2,3, forbedrede mikroskoper og elektronkilder 3,4,5, forbedringer i automatisering / gennemstrømning 6,7,8,9 og beregningsmæssige fremskridt inden for enkeltpartikelanalyse10,11,12,13 ,14 og tomografi15,16,17 er alle delvist ansvarlige for teknikkens nylige succes. Disse teknologiske drivkræfter har udviklet cryo-EM’s evne til at løse biologiske makromolekylære strukturer under kryogene og indfødte forhold. De opløsninger, der er let tilgængelige, er tilstrækkelige til atomnøjagtig modellering og har bragt teknikken i spidsen for den strukturelle biologiske arena. En reduktionistisk tilgang til at udtrykke og rense et biologisk mål af interesse har længe vist sig at være vellykket inden for makromolekylær krystallografi (MX) til grundlæggende biologisk forskning, lægemiddelopdagelse og translationel videnskab. I samme tilgang kan cryo-EM nu levere resultater, der er parallelle MX-studier med høj opløsning. Den nuværende store succes i cryo-EM-grenen af strukturbiologi kaldes enkeltpartikelanalyse (SPA), som erhverver 2D-projektionsbilleder typisk af et renset proteinprøve18 for at opnå tusindvis af visninger af et biologisk makromolekyle19. Disse billeder (1) indeholder information fra en række synspunkter, der fuldt ud repræsenterer målets orienteringer i 3D-rummet og (2) fanger objektets konformationelle heterogenitet, som senere kan adskilles og undersøges.
En alternativ tilgang til at erhverve disse 2D-projektionsbilleder af biologiske prøver, selv in situ og uden oprensning, er kryo-elektrontomografi (cryo-ET). Cryo-ET tager en række billeder af det samme objekt i skrå vinkler ved mekanisk at rotere prøven. Således indsamles de 2D-fremskrivninger, der er indsamlet i SPA, der repræsenterer vinkelstillingerne for det interessante molekyle, i sagens natur som en del af cryo-ET-billeddannelseseksperimentet20. Tomografiske vippeserier rekonstrueres derefter til et tomogram, der indeholder 3D-repræsentationer af de afbildede makromolekylære komplekser. Arten af tomografisk dataindsamling mindsker til en vis grad afhængigheden af gennemsnit for at opnå en fuld 3D-repræsentation af et molekyle fra en samling af 2D-billeder. På grund af nuværende scenedesign vippes prøven imidlertid typisk fra -60 ° til +60 °, hvilket efterlader en manglende kile21 af information i den tomografiske 3D-rekonstruktion.
3D-rekonstruktionerne i et enkelt tomogram har derefter en manglende kile af information og lavt signal til støj. Individuelle makromolekyler kan ekstraheres som subtomogrammer og gennemsnit sammen for at tackle dette. Hvor hvert makromolekyle i et subtomogram findes i en anden retning, er den manglende kile orienteret forskelligt i hvert subtomogram af målobjektet, så gennemsnit over mange kopier udfylder information på grund af den manglende kile. Den seneste udvikling inden for billedbehandling har også forsøgt at træne neurale netværk med kunstig intelligens til at udfylde den manglende kile med meningsfulde data22. Denne gennemsnitsproces øger også signalet til støj, svarende til målet om gennemsnit i enkeltpartikelanalyse, så rekonstruktionens kvalitet og opløsning forbedres. Hvis molekylet af interesse har symmetri, kan det også defineres og anvendes under gennemsnittet, hvilket yderligere forbedrer rekonstruktionsopløsningen. Ekstraktionen af 3D-volumener af et makromolekyle fra et tomogram til et sæt subtomogrammer og deres efterfølgende behandling er kendt som subtomogram averaging (STA)23. Hvor hvert subtomogram repræsenterer en unik kopi af molekylet, der undersøges, kan enhver strukturel heterogenitet forhøres ved hjælp af STA-arbejdsgangen. Som almindeligt anvendt i SPA-arbejdsgangen kan klassificeringsteknikker anvendes under STA til at dissekere konformationstilstandene i interessekomplekset. Ud over at STA muliggør rekonstruktion i høj opløsning i cryo-ET, gør denne tilgang teknikken til et kraftfuldt værktøj til at forhøre de strukturelle mekanismer for makromolekyler i deres oprindelige cellulære miljø eller af mål, der ofte ikke er modtagelige for SPA24,25,26.
Elektrontomografi har en lang historie med at bestemme 3D-ultrastrukturen af cellulære prøver ved stuetemperatur27. Erhvervelsen af visninger ved fysisk hældning af prøven giver tilstrækkelig information til 3D-rekonstruktionen af et objekt på cellelængdeskalaer og er især vigtigt, når cellulære strukturer mangler regelmæssigheden for gennemsnit. Celler kan også fryses på substrater til cryo-ET-billeddannelse ved cellekanterne, hvor prøven er tynd nok til at være elektrongennemsigtig. Under disse forhold kan STA anvendes til at bestemme makromolekylære strukturer i et cellulært miljø, omend når prøven er tynd nok til at være elektrongennemsigtig28. Men når det kombineres med yderligere forberedende teknikker, herunder kryokorrelativ lys- og elektronmikroskopi (cryo-CLEM) og fokuseret ionstrålefræsning (cryo-FIB), kan cryo-ET bruges til at afbilde inde i hele celler under kryogene forhold29. Dette samler kraften i cryo-ET til at studere den cellulære ultrastruktur med kraften i STA til at bestemme strukturerne af makromolekylære komplekser in situ , samtidig med at de identificerer deres cellulære placering30 og giver snapshots af komplekser, der er involveret i dynamiske processer31. Teknikkens evne til at afbilde cellulære prøver og anvende STA i flere undersøgelser har fremhævet teknikkens evne til at løse makromolekylære strukturer in situ , selv ved opløsninger, der kan sammenlignes med SPA32. En yderligere fordel findes i kendskabet til makromolekylets oprindelige placering, repræsenteret ved den endelige klassificerede 3D-rekonstruktion i tomogrammet30. Derfor kan den makromolekylære struktur korreleres med den cellulære ultrastruktur. Disse observationer på tværs af længdeskalaer vil formodentlig føre til vigtige fund, hvor strukturelle mekanismer kan korreleres med cellulære ændringer i forbindelse med funktionelle undersøgelser.
Cryo-ET og STA tillader dataindsamling i tre store arbejdsgange: molekylær, cellulær og lameltomografi. Strukturerne af oprensede makromolekylære komplekser kan bestemmes ved kryo-ET ved molekylær tomografi. Bestemmelse af proteinstrukturer i deres cellulære miljø, hvor cellen er tynd nok, kan beskrives som cellulær tomografi. For nylig, med udviklingen af kryogen målretning og fræsning, kan de samme teknikker anvendes i lamellatomografiarbejdsgange for at bestemme proteinstrukturerne dybt inde i cellen i deres oprindelige miljø, samtidig med at de afslører den cellulære kontekst, hvori disse proteiner observeres. Forskellige dataindsamlingsstrategier kan bruges afhængigt af de tilgængelige softwarepakker og vigtigst af alt afhængigt af prøvens krav. Molekylære eller ikke-klæbende prøver på et kobber TEM-gitter af et oprenset protein kræver typisk mindre håndtering og forbliver således fladt og ubeskadiget i ideelle tilfælde. Elektrontomogrammer kan let opsættes i serie på tværs af et hul-kulstofgitter for hurtigt at erhverve titusinder til hundredvis af tomogrammer på en systematisk måde. Den enkleste måde for brugerne at oprette molekylære tomografiprøver, hvor proteiner er rigeligt til stede på nettet, ville være at bruge Tomo5 (software til 3D-elektrontomografi, der anvendes i denne undersøgelse, se Materialetabel). Anden tomografisoftware såsom Leginon9 og serialEM6 er også tilgængelig; De tilbyder flere opsætningsmuligheder for mere personlige tilgange til dataindsamling, men er mere komplekse og kan derfor være sværere at navigere, især for brugere, der er nye inden for tomografi, og brugere, der får adgang til deres session eksternt. For et anlæg med en stor og forskelligartet brugerbase er Tomo5 let at betjene i et fjernmiljø og at træne brugere i. For klæbende celler kræver gitre typisk flere håndteringstrin, og nødvendigheden af at bruge skrøbelige guldgitter øger behovet for forbedret pleje i håndterings- og dataindsamlingsstrategier. For at gøre det lettere at finde et cellulært område af interesse og undgå okklusion fra selve gitteret ved høje hældningsvinkler, er det også en fordel at bruge større maskestørrelser, men til den pris, at de i sagens natur er mere skrøbelige. For lamellaprøver bestemmes prøvens skrøbelighed af lamellens kvalitet, som kan varieres. Disse faktorer øger opsætningstiden og overvejelserne, men den øgede tilpasningsevne og robusthed gør igen Tomo5 velegnet til denne type dataindsamling. Der findes dog specialiserede dataindsamlingsscenarier for hver arbejdsproces. BISECT og PACE-tomo (begge kørt i SerialEM) introducerer muligheden for scriptet strålebilledskift under tomografioptagelse for at øge tomogramindsamlingshastigheden28, især i molekylær tomografi. Medium forstørrelsesmontager (MMM) i SerialEM 6,7,33 kan bedre identificere og præcist målrette molekylære funktioner i alle arbejdsgange, selvom disse funktioner i skrivende stund begynder at blive implementeret i Tomo5.
Ligesom SPA bliver cryo-ET og STA mere og mere tilgængelige gennem forbedringerne af erhvervelsessoftware og et væld af tilgængelige pakker til subtomogram i gennemsnit 16,17,32,34,35,36,37,38. Derudover blev det under pandemien vigtigt at muliggøre fjernadgang til cryo-EM-instrumentering for den fortsatte drift af nationale faciliteter som electron Bio-Imaging Centre (eBIC) ved Diamond Light Source (DLS), Storbritannien. Denne udvikling har gjort cryo-ET mere tilgængelig og robust for forskere, der ønsker at udnytte teknikken. Når data er erhvervet, er STA et vigtigt værktøj til analyse af tilbagevendende objekter for at opnå rekonstruktion med maksimal opløsning og muliggøre klassificering af makromolekylær heterogenitet. Den nuværende protokol har til formål at give en detaljeret gennemgang af forberedelsen af et kryo-TEM-mikroskop til cryo-ET-dataindsamling, og hvordan man udfører subtomogramgennemsnit ved hjælp af emClarity på et molekylært tomografidatasæt af apoferritin som et eksempel. Brugen af emClarity (software til højopløsnings kryo-elektrontomografi og subtomogramgennemsnit, se Tabel over materialer) kræver kørsel af scripts fra kommandolinjen, så der antages et niveau af fortrolighed med Linux/UNIX-systemer.
Fjernforbindelsen afhænger af netværksmiljøet i hvert institut/facilitet. Hos eBIC bruger fjernsystemet programmer, der tillader fjerndataindsamling på den specifikke netværkskonfiguration, der bruges hos Diamond. Fjernforbindelse til mikroskopet lettes af to platforme: NoMachine og TeamViewer (se Materialetabel). Ved hjælp af programmet NoMachine kan brugeren logge på et eksternt Windows-skrivebord. Det eksterne Windows-skrivebord leveret af NoMachine ligger på samme netværk som mikroskopet og fungerer således som en virtuel support-pc til mikroskopet. Fra den virtuelle support-pc opretter brugeren forbindelse til mikroskopet via TeamViewer, der giver direkte adgang og kontrol til mikroskop-pc’en, der kører TUI og Tomo.
Den nuværende protokol består af to dele (trin 1 og trin 2). Trin 1 fokuserer på ekstern cryo-ET-dataindsamling ved hjælp af Tomo5 (software til 3D-elektrontomografi). Gennemgangen til en (fjern) session tager billeder med stadig højere forstørrelser for i sidste ende at give brugeren mulighed for at dirigere tomografisoftwaren til at målrette prøveområder til tomografisk dataindsamling. Figur 1 opsummerer denne proces. Trin 2 beskriver cryo-ET STA-databehandling ved hjælp af emClarity (software til højopløsnings kryo-elektrontomografi og subtomogramgennemsnit). Figur 9 opsummerer denne proces.
Protokollen er beregnet til et fjernpublikum. Det forudsætter, at personen fysisk ved mikroskopet og indlæsning af prøverne har foretaget de direkte justeringer og taget sig af kameraindstillingen og fået referenceoptagelse. Til denne protokol antages et trekondensatorlinsesystem med en autoloader. For yderligere detaljerede retningslinjer for tomografisoftwaren er en detaljeret manual fra producenten tilgængelig i Windows Start-knappen, hvor softwaren blev indlæst fra.
Tomo5
Arbejdsgangsbeskrivelsen af tomografisoftwaren fremhæver en potentiel og mest strømlinet måde til en (fjern) batchtomografisessionsopsætning. Mens softwaren er let for begyndere, kan nogle indledende cryo-EM-erfaringer og grundlæggende tomografiforståelse hjælpe med opsætningen. Kritiske trin er fremhævet i protokollen og bør hjælpe med fejlfinding, selvom der er brugt en anden opsætningsmetode. Udviklingen af softwaren vil lette (fjern) dataindsamling og gøre cryo-ET mere tilgængelig for en bred brugerbase. Et par tip og tricks, der kan hjælpe med at fejlfinde almindeligt opståede problemer, er beskrevet nedenfor.
Et vigtigt punkt at diskutere er valget af gitre, fordi gitterstænger ved høje hældninger kan skjule visningen, når prøven vippes til ±60 ° (figur 8). På et TEM-gitter refererer maskestørrelsen til antallet af gitterkvadrater pr. Enhedslængde af gitteret. Større maskenumre har flere gitterkvadrater pr. Enhedslængde, en højere tæthed af gitterkvadrater og mindre gitterkvadrater, dvs. et gitter med 400 mesh har mindre kvadrater end et 200-maskegitter. Et godt valg af gitter til tomografi er 200-mesh eller 300-mesh gitter. Som vist i figur 8 reduceres det tilgængelige område til indsamling, efterhånden som gitteret vippes. Ved ±60° hældning vil et gitter med 300 mesh have et lille synsfelt, hvorpå der kan erhverves et fuldt tomogram. Fordelene ved 200-mesh gitter er, at de større gitterfirkanter gør molekylær tomografiopsætning hurtigere, og med det øgede gitter-kvadratareal vil en firkant sandsynligvis være nok til en overnatningssamling. Ulempen er, at 200-mesh gitter er mere skrøbelige, så håndtering og klipning kræver mere finesse.
Hvis der anvendes hulstøttefilm (se Materialetabel) på EM-gitre, skal hulafstanden desuden tages i betragtning ved opsætning af fokus- og sporingsområdet i forhold til eksponeringsområdet. Ideelt set bør strålediameteren ved den ønskede forstørrelse være lille nok til at dække kulstofområdet ved siden af eksponeringsområdet langs hældningsaksen for optimal og hurtig opsætning. På denne måde kan potentielle regioner af interesse for hvert hul erhverves.
Da softwarens eucentriske højderutine i øjeblikket ikke er så robust, såsom serialEM-rutinen, kan følgende tip løse dette problem. Hvis den eucentriske højdebestemmelse mislykkes ved hjælp af den eucentriske højdeforudindstilling, kan man bruge oversigtsforudindstillingen i stedet og køre “Auto-eucentrisk ved trinhældning” igen; Dette kan løse problemer, hvis den eucentriske højde er langt væk fra 0. Hvis dette lykkes, kan man køre “Auto-eucentrisk by stage tilt” med “Eucentric Height” forudindstillinger for at forbedre præcisionen. Hvis det mislykkes, kan man køre “Auto-Eucentric by beam tilt” med den eucentriske højdeforudindstilling og derefter køre “Auto-Eucentric by stage tilt” eller manuelt indstille z-højden konsolideret af “Auto-Eucentric by beam tilt” i TEM-brugergrænsefladen under “Stage” -indstillinger. Hvis der anvendes gitre med et gentagende mønster af huller, kan de forhindre identifikation af en enkelt krydskorrelationstop. Man kan prøve at ændre den eucentriske højdeforudindstilling til en lavere defokusforskydning såsom -25 μm og / eller en kortere eksponeringstid for at reducere krydskorrelation fra hulmønstrene. På den anden side giver brug af lacey grids / lameller muligvis ikke tilstrækkeligt signal til en stærk krydskorrelationstop. Man kan prøve at ændre den eucentriske højdeforudindstilling til en større defokusforskydning såsom -75 μm og / eller en forlænget eksponeringstid for at forbedre krydskorrelationstoppen. En anden mulighed er at justere billedfilterindstillinger; de findes på fanen “Forberedelse”. Indstillinger til justering af filterindstillingerne kan indstilles for lav (Oversigt / Gridsquare), medium (eucentrisk højde) og høj forstørrelse (sporing / fokus) for at finde den optimale krydskorrelationstop for hver forudindstilling. Det krævede input er et billede, dvs. ved 0° og et ved 5°, efterfulgt af at klikke på Sammenlign for at sammenligne begge billeder. Den anbefalede startværdi for den længste bølgelængde er en fjerdedel af skalalinjen på billedet og for den korteste bølgelængde en fyrretyvendedel af skalalinjen. Hvis toppen ikke er robust identificeret, kan man optimere indstillingerne, indtil der kan findes en overbevisende top. Der er ingen grund til at generhverve billeder hver gang; det er nok blot at trykke på “Sammenlign”. Hvis TOMO stadig ikke automatisk kan finde den eucentriske højde, kan den manuelle eucentriske højdekalibrering anvendes. Man skal centrere over en rimelig stor iskrystal i oversigtsforstørrelse på fanen “Forberedelse”, derefter gå til “Stage-kontrollen” i TEM-brugergrænsefladen, indstille alfa til -30 ° og justere trin z-værdien for at centrere krystallen igen ved hjælp af det fluorescerende skærmbillede. Hvis du vælger indstillingerne “Høj opløsning” og “Høj kontrast” i TEM-brugergrænsefladen, bliver dette enkelt (knapper nederst i det fluorescerende skærmvindue). Eventuelt, hvis der er adgang til et kamera med live-tilstand, kan dette bruges til at bestemme den eucentriske højde; Det bliver lettere end på den fluorescerende skærm.
De største begrænsninger i Tomo5-versioner før 5.8 er de manglende mellemforstørrelsesmontager, manglende dosissymmetrisk skema og problemer relateret til eucentrisk højdefinding. Disse findes i serialEM, et freeware med hurtig udvikling og fællesskabsstøtte, en robust eucentrisk højderutine og muligheden for at scripte, dvs. et specialbygget dosissymmetrisk skema. Fra version 5.8 og fremefter i Tomo5 er det mest almindeligt forekommende problem med at finde den eucentriske højde, dvs. en mislykket looping omkring målet z-værdi, blevet løst ved at implementere muligheden for at indstille et eucentrisk højdeacceptkriterium. Men med forskellige gitter- og prøvetyper anbefales det stærkt at justere billedfilterindstillingerne for at afspejle de unikke billeddannelsesbetingelser for individuelle sessioner og for at give den bedst mulige krydskorrelationstop for at finde den eucentriske højde og for fokus- og sporingsområdet at fungere pålideligt under tomogramoptagelse.
Samlet set har mange faciliteter hurtigt tilpasset sig fjerndrift under pandemien. Tomo5-softwaren giver en nem adgang og brugervenlig rute til tomografi, som er velegnet til fjernbetjening. De fremskridt, der er gjort i softwaren, vil uden tvivl fortsætte med at gøre fjerndataindsamlinger og tomografiindsamling generelt mere mainstream i samfundet.
emKlarhed
Da emClarity bruger en skabelonbaseret partikelplukningsmetode, har den brug for en skabelon til objektet af interesse. Partikelplukningen (trin 2.6) er meget følsom og nøglen til den endelige struktur. Før gennemsnit og justering (trin 2.9) skal man sørge for at kontrollere omhyggeligt og manuelt fjerne de falske positiver. Når en skabelon ikke er tilgængelig, er emClarity muligvis ikke let at bruge, men det er muligt at bruge anden software, for eksempel Dynamo37 og PEET48, til at oprette en indledende model.
For heterogene prøver er emClarity udstyret med en klassificeringsmetode, der gør det muligt for brugerne at fokusere på specifikke funktioner med forskellige skalaer. Det er nyttigt at køre et par cyklusser med justeringer før klassificering og køre det ved en højere binning (såsom skraldespand 4 eller skraldespand 3).
Den opdaterede version af softwaren (V1.5.3.11) har betydelige opdateringer sammenlignet med den første version (V1.0)17. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, en håndsrækningskontrol under CTF-estimering (trin 2.3); symmetri for justeringer (CX, I, I2, O); beregning af 3D-prøveudtagningsfunktioner pr. partikel (3DSF) et skift til MATLAB 2019a for kompatibilitet og stabilitet; og rekonstruktion ved hjælp af de rå projektionsbilleder (cisTEM). Softwaren vil fortsætte med at forbedre for forskellige prøver, og de nyeste meddelelser kan findes online (se Materialetabel).
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Diamond Light Source for adgang til og støtte til cryo-EM-faciliteterne på Storbritanniens nationale Electron Bio-Imaging Center (eBIC), finansieret af Wellcome Trust, MRC og BBRSC. Vi vil også gerne takke Andrew Howe for erhvervelsen af Apoferritin-tomogrammet (film 1), Ishika Kumar for forberedelsen og erhvervelsen af neurontomogrammet (film 2) og Craig MacGregor-Chatwin for cyanobakterierne lamel-tomogrammet (film 3).
Software | |||
Tomography | Thermo Fisher Scientific | 5.9.0 | Internal terminology: Tomo5 in document |
TEM server | Thermo Fisher Scientific | 7.10.1 | |
TIA | Thermo Fisher Scientific | 5.10.1 | |
DigitalMicrograph | Gatan | 3.44 | |
emClarity | Open-Source software | 1.5.3.11 | Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging |
IMOD | Open-Source software | 4.11 | Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data |
MotionCor2 | Free for academic use | 1.1.0 | A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded on dose fractionated movie stacks |
ETomo | Open-Source software | 4.11 | ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. |
NoMachine | NoMachine, freeware | 7.9.2 | Remote desktop software |
TeamViewer | TeamViewer AG | – | Remote access and remote control computer software |
Materials | |||
Quantifoil (holey support film) EM grids | Quantifoil | – | A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement |
Instrumentation | |||
Titan Krios microscope | Thermo Fisher Scientific | Titan Krios G2 | |
K3 camera and GIB energy filter | Gatan | – | |
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | – | |
Website | |||
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ | – | – | Link to download the emClarity software package |
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ | – | – | Link to download IMOD |
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial | – | – | Link to the emClarity online tutorial |
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | – | – | Link to download MotionCor2 |
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki | – | – | Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity |