Biorreactor de perfusión multiflujo integrado con fraccionamiento de salida para cultivo celular dinámico

Summary

Este artículo presenta un método para construir y operar un sistema de cultivo celular de perfusión multicanal de bajo costo para medir la dinámica de las tasas de secreción y absorción de solutos en procesos celulares. El sistema también puede exponer las células a perfiles de estímulo dinámicos.

Abstract

Ciertas funciones celulares y tisulares operan dentro de la escala de tiempo dinámica de minutos a horas que están mal resueltas por los sistemas de cultivo convencionales. Este trabajo ha desarrollado un sistema de biorreactor de perfusión de bajo costo que permite que el medio de cultivo se perfunda continuamente en un módulo de cultivo celular y se fraccione en un módulo aguas abajo para medir la dinámica a esta escala. El sistema está construido casi en su totalidad a partir de piezas disponibles comercialmente y se puede paralelizar para realizar experimentos independientes en placas de cultivo celular convencionales de múltiples pozos simultáneamente. Este artículo de vídeo muestra cómo ensamblar la configuración de la base, que requiere solo una bomba de jeringa multicanal y un colector de fracción modificado para perfundir hasta seis cultivos en paralelo. También se presentan variantes útiles en el diseño modular que permiten una dinámica de estimulación controlada, como pulsos de soluto o perfiles farmacocinéticos. Es importante destacar que, a medida que las señales de soluto viajan a través del sistema, se distorsionan debido a la dispersión de solutos. Además, se describe un método para medir las distribuciones de tiempo de residencia (RTD) de los componentes de la configuración de perfusión con un trazador utilizando MATLAB. Los RTD son útiles para calcular cómo las señales de soluto son distorsionadas por el flujo en el sistema multicompartimento. Este sistema es altamente robusto y reproducible, por lo que los investigadores básicos pueden adoptarlo fácilmente sin la necesidad de instalaciones de fabricación especializadas.

Introduction

Muchos procesos biológicos importantes ocurren en cultivos celulares y tisulares en la escala de tiempo de minutos a horas ^1,2,3. Si bien algunos de estos fenómenos pueden observarse y registrarse de manera automatizada utilizando microscopía de lapso de tiempo⁴, bioluminiscencia¹ u otros métodos, los experimentos que involucran la recolección de muestras de sobrenadantes de cultivo para análisis químico a menudo se realizan manualmente en cultivos celulares estáticos. El muestreo manual limita la viabilidad de ciertos estudios debido a la inconveniencia de los puntos de tiempo de muestreo frecuentes o fuera del horario laboral. Otras deficiencias de los métodos de cultivo estático incluyen experimentos que involucran exposiciones controladas y transitorias a estímulos químicos. En los cultivos estáticos, los estímulos deben agregarse y eliminarse manualmente, y los perfiles de estímulo se limitan a los cambios de paso a lo largo del tiempo, mientras que los cambios de medio también agregan y eliminan otros componentes del medio, que pueden afectar a las células de manera incontrolada⁵. Los sistemas fluídicos pueden superar estos desafíos, pero los dispositivos existentes plantean otros desafíos. Los dispositivos microfluídicos vienen con los costos prohibitivos de equipos especializados y capacitación para producir y usar, requieren métodos microanalíticos para procesar muestras y las células son difíciles de recuperar de los dispositivos después de la perfusión⁶. Se han creado pocos sistemas macrofluídicos para los tipos de experimentos descritos aquí 7,8,9,10, y están construidos con múltiples piezas personalizadas hechas internamente y requieren múltiples bombas o colectores de fracción. Además, los autores no tienen conocimiento de ningún sistema de cultivo de células de perfusión macrofluídica disponible comercialmente que no sean biorreactores de tanque agitado para cultivo en suspensión, que son útiles para la biofabricación, aunque no están diseñados para modelar y estudiar la fisiología.

Los autores informaron previamente sobre el diseño de un sistema de biorreactor de perfusión de bajo costo compuesto casi en su totalidad por partes¹¹ disponibles comercialmente. La versión base del sistema permite que múltiples cultivos en una placa de pozo se mantengan en una incubadora de CO₂ y se perfundan continuamente con el medio de una bomba de jeringa, mientras que las corrientes de medios de efluentes de los cultivos se fraccionan automáticamente en muestras a lo largo del tiempo utilizando un colector de fracción con una modificación personalizada. Por lo tanto, este sistema permite el muestreo automatizado del sobrenadante del medio de cultivo y la entrada continua de solutos a los cultivos a lo largo del tiempo. El sistema es macrofluídico y modular y se puede modificar fácilmente para satisfacer las necesidades de nuevos diseños de experimentos.

El objetivo general del método presentado aquí es construir, caracterizar y utilizar un sistema de cultivo celular de perfusión que permita experimentos en los que se midan las tasas de secreción o absorción de sustancias por parte de las células a lo largo del tiempo, y / o las células estén expuestas a señales de soluto precisas y transitorias. Este artículo en video explica cómo ensamblar la configuración de la base, que es capaz de perfundir hasta seis cultivos celulares simultáneamente utilizando una sola bomba de jeringa y un colector de fracción modificado. También se presentan dos variantes útiles en el sistema base que hacen uso de bombas y piezas adicionales para permitir experimentos que exponen a las células a señales transitorias de concentración de solutos, incluidos pulsos breves y perfiles farmacocinéticos¹², que se muestran en la Figura 1.

Figura 1: Tres variaciones en el diseño del sistema de perfusión. (Arriba) El sistema básico de perfusión. (Medio) El sistema de perfusión con una llave de paso para múltiples fuentes medias. (Abajo) El sistema de perfusión con un tanque agitado para imitar un volumen de distribución bien mezclado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Debido a la dispersión y difusión dentro del flujo, las señales de soluto se distorsionan o “manchan” a medida que viajan a través del sistema de flujo. Esta distorsión puede cuantificarse mediante el uso de distribuciones de tiempo de residencia (IDT)¹³. En este artículo se explica cómo realizar experimentos de trazador en componentes del sistema de perfusión (Figura 2) y se proporcionan scripts de MATLAB para generar RTD a partir de datos medidos. Una explicación detallada de este análisis se puede encontrar en el artículo anterior de los autores¹¹. Los scripts adicionales de MATLAB se ajustan a las funciones adecuadas a los RTD y extraen parámetros físicos, y realizan la convolución de la señal utilizando RTD para predecir cómo se propagará y distorsionará la entrada de señal de soluto por parte del usuario a través del sistema de perfusión¹⁴.

Figura 2: Distribuciones del tiempo de residencia. Los RTD de los componentes del sistema de flujo, como esta longitud de tubería, se miden introduciendo un pulso de trazador en el sistema y midiendo cómo se “mancha” en el momento en que sale a las fracciones recolectadas. Esta cifra ha sido modificada a partir de Erickson et ^al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Prepare las piezas para la perfusión de la placa del pozo Preparar tubos Cortar dos longitudes de tubo de silicona (1,6 mm de diámetro interior) para cada cultivo celular a perfundir. Asegúrese de que la pieza utilizada como tubo aguas arriba sea lo suficientemente larga como para llegar desde la bomba de la jeringa hasta el cultivo celular dentro de la incubadora, y que la pieza aguas abajo pueda llegar desde el cultivo celular hasta la posición extendida más lejana del colecto…

Representative Results

El sistema de perfusión con múltiples fuentes de medios de la sección 5 del protocolo se utilizó para medir la dinámica de expresión de un gen reportero impulsado por el factor de transcripción del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-κB) del factor de necrosis tumoral activado del factor de necrosis tumoral de 1,5 h (TNF-α). Las células HEK293 se transdujeron de manera estable utilizando vectores lentivirales con una construcción genética que contenía Gaussia luciferasa (GLuc), impulsada por un promotor lla…

Discussion

Este trabajo describe el ensamblaje y operación de un sistema de cultivo celular de perfusión con múltiples fuentes de medios demostradas con un ejemplo específico en el que se midió la dinámica de la expresión génica impulsada por NF-κB en respuesta a un pulso transitorio de TNF-α. Se midieron y modelaron los RTD de los componentes del sistema de perfusión, y se utilizó la convolución de la señal para predecir tanto la exposición de las células al pulso TNF-α como la distribución TNF-α en las fraccion…

Materials

18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines	Grainger	5FVK2
293T Cells	ATCC	CRL-3216	HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-Well Clear Bottom Plates, Corning	VWR	89091-010	Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
BioFrac Fraction Collector	Bio-Rad	7410002	Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8"	McMaster-Carr	4615T93	This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells	Millipore Sigma	CLS3548	Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells	Fisher Scientific	720081	Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Laser	Cutting Edge Systems	Epilog Zing 24	Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129	Microcentrifuge tubes for collecting fractions.
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End	Fisher Scientific	14-961-26	Glass tubes for collecting fractions.
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered	Fisher Scientific	2707410	300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	21600010	Phosphate buffered saline.
Labline 4625 Titer Shaker	Marshall Scientific	Labline 4625 Titer Shaker	Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16"	Cole-Parmer	EW-45508-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-1600
Rack Set F1	Bio-Rad	7410010	Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF	Bio-Techne	10291-TA-020	Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm	Saint Gobain	DX263015-50	Fits 48-well plates.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm	Saint Gobain	DX263027-10	Fits 12-well plates.
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems	SolidWorks	CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Plate reader.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue	Michaels	10404779	Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.