تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال بوساطة فيروسية إلى hESCs و NPCs باستخدام بولي إيثيلينيمين البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة (PEI)
Summary
باستخدام البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI) ، أنتجنا جزيئات فيروسية لينتيفيروسية للتعبير المستقر عن shRNAs في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H9 (hESCs) والخلايا السلفية العصبية المشتقة من H9 (NPCs) بكفاءة عالية.
Abstract
يصف البروتوكول الحالي استخدام الجسيمات الفيروسية اللينتيفيروسية لتوصيل الحمض النووي الريبي قصير الدبوس الشعري (shRNAs) إلى كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وكذلك الخلايا السلفية العصبية (NPCs) المشتقة من hESCs بكفاءة عالية. تم توليد جزيئات الفيروس العاصف عن طريق النقل المشترك لخلايا HEK293T باستخدام ناقلات الدخول (التي تحمل shRNAs) جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف (pAX و pMD2.G) باستخدام بوليمر البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI). وتركزت الجسيمات الفيروسية باستخدام الطرد المركزي الفائق، مما أدى إلى متوسط عيارات أعلى من 5 × 107. يمكن أن تصاب كل من hESCs و NPCs بكفاءة عالية باستخدام هذه الجسيمات الفيروسية ، كما هو موضح في اختيار puromycin والتعبير المستقر في hESCs ، وكذلك تعبير GFP العابر في NPCs. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل اللطخة الغربية انخفاضا كبيرا في التعبير عن الجينات التي تستهدفها shRNAs. بالإضافة إلى ذلك ، احتفظت الخلايا بتعدد قدراتها وكذلك إمكانات التمايز ، كما يتضح من تمايزها اللاحق إلى سلالات مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. ويتناول البروتوكول الحالي تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام نفس النهج للتعبير خارج الرحم عن cDNAs لدراسات التعبير المفرط.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) المشتقة من كتلة الخلايا الداخلية للكيسة الأريمية متعددة القدرات ويمكن تمييزها إلى أنواع مختلفة من الخلايا اعتمادا على العوامل الخارجية في ظل ظروف المختبر 1,2. من أجل تسخير إمكانات hESCs بشكل كامل ، من الضروري أن يكون لديك طرق سريعة وموثوقة لتوصيل الجينات لهذه الخلايا. تقليديا ، يمكن تصنيف التقنيات المستخدمة على نطاق واسع إلى نوعين: أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية والفيروسية 3,4. أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية الأكثر استخداما هي lipofection و electroporation و nucleofection. تعد أنظمة التوصيل غير الفيروسية مفيدة بسبب عدد أقل من طفرات الإدخال وانخفاض إجمالي في المناعة 5,6. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل ومدة قصيرة من التعبير الجيني العابر ، وهو قيد رئيسي لدراسات التمايز طويلة الأجل7. يؤدي النقل الكهربائي إلى تحسين كفاءة النقل مقارنة ب lipofection. ومع ذلك ، فإنه يؤدي إلى أكثر من 50 ٪ من موت الخلايا8،9،10. باستخدام nucleofection ، يمكن تحسين بقاء الخلية وكفاءة النقل من خلال الجمع بين lipofection و electroporation ، ولكن النهج يحتاج إلى مخازن مؤقتة خاصة بالخلايا ومعدات متخصصة ، وبالتالي ، يصبح مكلفا للغاية للتطبيقات الموسعة11,12.
وعلى النقيض من ذلك، أظهرت النواقل الفيروسية تحسنا في كفاءة نقل العدوى، فضلا عن انخفاض السمية الخلوية عموما، بعد النقل. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن الجينات التي يتم تسليمها بثبات ، وبالتالي ، تجعل هذه الطريقة مثالية للدراسات طويلة الأجل13. من بين النواقل الفيروسية الأكثر استخداما لتوصيل الجينات إلى hESCs هي ناقلات الفيروسات الليفية (LVS) ، والتي يمكن أن تعطي أكثر من 80٪ من كفاءة النقل باستخدام جزيئات فيروسية عالية العيار14,15. يعد Lipofection و CaPO4 هطول الأمطار من بين الطرق الأكثر استخداما لنقل خلايا HEK293T أو مشتقاتها بشكل عابر مع ناقلات نقل الجينات جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف لإنتاج جزيئات فيروسية16. على الرغم من أن lipofection يؤدي إلى كفاءة نقل جيدة وسمية خلوية منخفضة ، إلا أن هذه التقنية تعوقها تكلفتها ، وسيكون التوسع للحصول على جزيئات عالية العيار lentiviral مكلفا للغاية. ينتج عن هطول الأمطار CaPO4 كفاءة نقل مماثلة نسبيا لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام lipofection. على الرغم من فعالية التكلفة ، إلا أن هطول الأمطار CaPO4 يؤدي إلى موت كبير للخلايا بعد عمليات النقل ، مما يجعل من الصعب توحيد وتجنب الاختلافات من دفعة إلى دفعة17. في هذا السيناريو ، يعد تطوير طريقة تعطي كفاءة نقل عالية ، وسمية خلوية منخفضة ، وفعالية من حيث التكلفة أمرا بالغ الأهمية لإنتاج جزيئات عالية التيتر lentiviral لاستخدامها في hESCs.
البولي إيثيلينيمين (PEI) هو بوليمر كاتيوني يمكنه نقل خلايا HEK293T بكفاءة عالية دون الكثير من السمية الخلوية وله تكلفة ضئيلة مقارنة بالطرق القائمة على lipofection18. في هذه الحالة ، يمكن استخدام جزيرة برنس إدوارد للتطبيقات الموسعة لإنتاج LVS عالي العيار من خلال تركيز جزيئات lentiviral من supernatants المستنبتة باستخدام تقنيات مختلفة. تصف المقالة المقدمة استخدام جزيرة برنس إدوارد لنقل خلايا HEK293T وتركيز ناقلات الفيروسات الوعائية باستخدام الطرد المركزي الفائق من خلال وسادة السكروز. باستخدام هذه الطريقة ، نحصل بانتظام على عيارات أعلى بكثير من 5 × 107 وحدة دولية / مل مع اختلافات منخفضة من دفعة إلى دفعة. هذه الطريقة بسيطة ومباشرة وفعالة من حيث التكلفة للتطبيقات الموسعة لتوصيل الجينات إلى hESCs والخلايا المشتقة من hESCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على تعديل الخلايا الجذعية وراثيا لأغراض الدراسة أو السريرية محدودة من خلال التكنولوجيا والفهم الأساسي لبيولوجيا hESCs. التقنيات التي أظهرت إمكانات كبيرة في ESCs الفئران ، مثل lipofection و electroporation ، ليست فعالة للغاية بالنسبة ل hESCs ، والتي تشتهر بصعوبة توصيل الجينات بالطرق التقليدية<sup class="xr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية من جامعة الإمارات العربية المتحدة (UAEU) ، والمنحة رقم 31R170 (مركز زايد للعلوم الصحية) و # 12R010 (منحة جامعة الإمارات العربية المتحدة). نشكر البروفيسور راندال مورس (مركز وادزورث، ألباني، نيويورك) على مساعدتنا في تحرير المخطوطة من حيث الأسلوب والقواعد.
جميع البيانات متاحة عند الطلب.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O’Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017 (2016).
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
