Consegna mediata lentivirale di shRNA a hESC e NPC utilizzando polietilenimina polimerica cationica a basso costo (PEI)

Summary

Utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimina (PEI), abbiamo prodotto particelle lentivirali per l’espressione stabile di shRNA in cellule staminali embrionali umane H9 (hESC) e cellule progenitrici neurali derivate da H9 trasdotte transitoriamente (NPC) ad alta efficienza.

Abstract

L’attuale protocollo descrive l’uso di particelle lentivirali per la somministrazione di RNA a forcina corta (shRNA) sia alle cellule staminali embrionali umane (hESC) che alle cellule progenitrici neurali (NPC) derivate da hESC ad alta efficienza. Le particelle lentivirali sono state generate co-trasfettando le cellule HEK293T utilizzando vettori di ingresso (che trasportano shRNA) insieme a plasmidi di imballaggio (pAX e pMD2.G) utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimmina (PEI). Le particelle virali sono state concentrate utilizzando l’ultracentrifugazione, che ha portato a titoli medi superiori a 5 x 10⁷. Sia le hESC che le NPC potrebbero essere infettate ad alta efficienza utilizzando queste particelle lentivirali, come dimostrato dalla selezione della puromicina e dall’espressione stabile nelle hESC, nonché dall’espressione transitoria della GFP nelle NPC. Inoltre, l’analisi western blot ha mostrato una significativa riduzione dell’espressione dei geni presi di mira dagli shRNA. Inoltre, le cellule hanno mantenuto la loro pluripotenza e il potenziale di differenziazione, come evidenziato dalla loro successiva differenziazione in diversi lignaggi del SNC. L’attuale protocollo si occupa della consegna di shRNA; tuttavia, lo stesso approccio potrebbe essere utilizzato per l’espressione ectopica dei cDNA per gli studi di sovraespressione.

Introduction

Le cellule staminali embrionali umane (hESC) derivate dalla massa cellulare interna della blastocisti sono pluripotenti e possono essere differenziate in diversi tipi di cellule a seconda di fattori esterni in condizioni in vitro ^1,2. Al fine di sfruttare appieno il potenziale delle hESC, è imperativo disporre di metodi di consegna genica rapidi e affidabili per queste cellule. Convenzionalmente, le tecniche utilizzate possono essere ampiamente classificate in due tipi: sistemi di consegna genica non virale e virale ^3,4. I sistemi di consegna genica non virale più frequentemente utilizzati sono la lipofezione, l’elettroporazione e la nucleofezione. I sistemi di somministrazione non virale sono vantaggiosi a causa del minor numero di mutazioni di inserzione e di una diminuzione complessiva dell’immunogenicità ^5,6. Tuttavia, questi metodi si traducono in una bassa efficienza di trasfezione e una breve durata dell’espressione genica transitoria, che è una delle principali limitazioni per gli studi di differenziazione a lungo termine⁷. L’elettroporazione si traduce in migliori efficienze di trasfezione rispetto alla lipofezione; tuttavia, si traduce in oltre il 50% di morte cellulare ^8,9,10. Utilizzando la nucleofezione, la sopravvivenza cellulare e l’efficienza della trasfezione possono essere migliorate combinando lipofezione ed elettroporazione, ma l’approccio richiede tamponi specifici per le cellule e attrezzature specializzate e, quindi, diventa piuttosto costoso per le applicazioni scaled-up^11,12.

Al contrario, i vettori virali hanno mostrato una migliore efficienza di trasfezione, così come una bassa citotossicità complessiva, dopo la trasduzione. Inoltre, i geni consegnati sono espressi stabilmente e, quindi, rendono questo metodo ideale per studi a lungo termine¹³. Tra i vettori virali più comunemente usati per la consegna genica nelle hESC ci sono i vettori lentivirali (LVS), che possono dare un’efficienza di trasduzione superiore all’80% utilizzando particelle virali ad alto titolo^14,15. La lipofezione e la precipitazione di CaPO₄ sono tra i metodi più comunemente usati per trasfettare transitoriamente le cellule HEK293T o i suoi derivati con vettori di trasferimento genico insieme a plasmidi di imballaggio per produrre particelle lentivirali¹⁶. Sebbene la lipofezione si traduca in una buona efficienza di trasfezione e bassa citotossicità, la tecnica è ostacolata dal suo costo e il ridimensionamento per ottenere particelle lentivirali ad alto titolo sarebbe molto costoso. La precipitazione di CaPO₄ si traduce in efficienze di trasfezione relativamente simili a quelle ottenute utilizzando la lipofezione. Sebbene economicamente vantaggiosa, la precipitazione di CaPO₄ provoca una significativa morte cellulare a seguito di trasfezioni, il che rende difficile standardizzare ed evitare variazioni da lotto a lotto¹⁷. In questo scenario, lo sviluppo di un metodo che dia un’elevata efficienza di trasfezione, bassa citotossicità ed economicità è fondamentale per la produzione di particelle lentivirali ad alto titolo da utilizzare nelle hESC.

La polietilenimina (PEI) è un polimero cationico in grado di trasfettare le cellule HEK293T ad alta efficienza senza molta citotossicità e ha un costo trascurabile rispetto ai metodi basati sulla lipofezione¹⁸. In questa situazione, PEI può essere utilizzato per applicazioni su larga scala di produzione di LVS ad alto titolo attraverso la concentrazione di particelle lentivirali da supernatanti di coltura utilizzando varie tecniche. L’articolo presentato descrive l’uso del PEI per trasfettare le cellule HEK293T e la concentrazione del vettore lentivirale utilizzando l’ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio. Usando questo metodo, otteniamo regolarmente titoli ben al di sopra di 5 x 10⁷ UI / mL con basse variazioni da lotto a lotto. Il metodo è semplice, diretto ed economico per applicazioni su larga scala per la consegna di geni a hESC e cellule derivate da hESC.

Protocol

1. Trasfezione di cellule HEK293T utilizzando PEI o lipofectamine 3000 reagente Coltiva cellule HEK293T in DMEM + 10% FBS + 1x penicillina/streptomicina a 37 °C in un incubatore umidificato con un’atmosfera del 5% CO2 e 21% O2 fino a quando non sono confluenti al 90% prima della semina per la trasfezione. Utilizzare un numero di cellule di passaggio relativamente basso per un’elevata produzione di virus del titolo (idealmente inferiore a P30). Semina 4 x 10…

Representative Results

A seguito del trasferimento genico, è inevitabilmente richiesta un’elevata vitalità delle hESC. Nonostante gli sforzi e l’ottimizzazione dei protocolli per ridurre la morte cellulare a seguito dell’elettroporazione delle hESC, oltre il 50% della morte cellulare è ancora osservato dopo l’elettroporazione di queste cellule, insieme a una bassa efficienza di trasfezione20. Il trasferimento genico mediato da lentivirale non solo si traduce in un’elevata efficienza del trasferimento genico, ma dimos…

Discussion

La capacità di modificare geneticamente le cellule staminali per scopi di studio o clinici è limitata sia dalla tecnologia che dalla comprensione di base della biologia delle hESC. Le tecniche che hanno mostrato un potenziale significativo nelle ESC di topo, come la lipofezione e l’elettroporazione, non sono altamente efficienti per le hESC, che sono notoriamente difficili per la consegna genica con metodi convenzionali²⁰. Questa nozione ha portato non solo all’ottimizzazione delle tecniche esis…

Materials

2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10