Ved hjelp av lavkost kationisk polymerpolyetylenimine (PEI) produserte vi lentivirale partikler for stabilt uttrykk av shRNA i H9 humane embryonale stamceller (hESCs) og forbigående transducerte H9-avledede nevrale stamceller (NPC) ved høy effektivitet.
Den nåværende protokollen beskriver bruken av lentivirale partikler for levering av kort hårnålsRNA (shRNA) til både humane embryonale stamceller (hESC) samt nevrale stamceller (NPC) avledet fra hESCs ved høy effektivitet. Lentivirale partikler ble generert ved å co-transfektere HEK293T-celler ved hjelp av inngangsvektorer (bærer shRNA) sammen med emballasjeplasmider (pAX og pMD2.G) ved bruk av lavpris kationisk polymerpolyetylenimine (PEI). Viruspartikler ble konsentrert ved hjelp av ultrasentrifugering, noe som resulterte i gjennomsnittlige titere over 5 x 107. Både hESC og NPC kan infiseres med høy effektivitet ved bruk av disse lentivirale partiklene, som vist ved puromycinvalg og stabilt uttrykk i hESC, samt forbigående GFP-uttrykk i NPCer. Videre viste western blot-analyse en signifikant reduksjon i uttrykket av gener målrettet av shRNA. I tillegg beholdt cellene sin pluripotens så vel som differensieringspotensial, som det fremgår av deres etterfølgende differensiering i forskjellige linjer av CNS. Den nåværende protokollen omhandler levering av shRNA; Den samme tilnærmingen kan imidlertid brukes til ektopisk ekspresjon av cDNA for overekspresjonsstudier.
Humane embryonale stamceller (hESC) avledet fra blastocystens indre cellemasse er pluripotente og kan differensieres til forskjellige celletyper avhengig av eksterne faktorer under in vitro-tilstander 1,2. For å fullt ut utnytte potensialet til hESCs, er det viktig å ha raske og pålitelige genleveringsmetoder for disse cellene. Konvensjonelt kan teknikkene som brukes grovt klassifiseres i to typer: ikke-smittsomme og virale genleveringssystemer 3,4. De hyppigere brukte ikke-smittsomme genleveringssystemene er fettinfeksjon, elektroporering og nukleofeksjon. Ikke-miljømessige leveringssystemer er fordelaktige på grunn av færre innsettingsmutasjoner og en generell reduksjon i immunogenisitet 5,6. Imidlertid resulterer disse metodene i lav transfeksjonseffektivitet og kort varighet av forbigående genuttrykk, noe som er en stor begrensning for langsiktige differensieringsstudier7. Elektroporering resulterer i bedre transfeksjonseffektivitet sammenlignet med fettinfeksjon; Det resulterer imidlertid i mer enn 50% celledød 8,9,10. Ved hjelp av nukleofeksjon kan celleoverlevelsen og transfeksjonseffektiviteten forbedres ved å kombinere fettinfeksjon og elektroporering, men tilnærmingen trenger cellespesifikke buffere og spesialutstyr og blir dermed ganske kostbar for oppskalerte applikasjoner11,12.
I motsetning til dette har virale vektorer vist forbedret transfeksjonseffektivitet, samt generell lav cytotoksisitet, etter transduksjon. I tillegg er genene som leveres stabilt uttrykt og dermed gjør denne metoden ideell for langsiktige studier13. Blant de mest brukte virale vektorene for genlevering i hESC er lentivirale vektorer (LVS), som kan gi mer enn 80% transduksjonseffektivitet ved bruk av høye titerviruspartikler14,15. Fettinfeksjon og CaPO 4-utfelling er blant de mest brukte metodene for å forbigående transfektere HEK293T-celler eller dets derivater med genoverføringsvektorer sammen med emballasjeplasmider for å gi lentivirale partikler16. Selv om fettinfeksjon resulterer i god transfeksjonseffektivitet og lav cytotoksisitet, hindres teknikken av kostnadene, og oppskalering for å få høye titer lentivirale partikler vil være svært kostbart. CaPO 4-utfelling resulterer i relativt lik transfeksjonseffektivitet som de som oppnås ved bruk av fettinfeksjon. Selv omdet er kostnadseffektivt, resulterer CaPO 4-utfelling i betydelig celledød etter transfeksjoner, noe som gjør det vanskelig å standardisere og unngå batch-til-batch-variasjoner17. I dette scenariet er utvikling av en metode som gir høy transfeksjonseffektivitet, lav cytotoksisitet og kostnadseffektivitet avgjørende for produksjon av lentivirale partikler med høy titer som skal brukes i hESC.
Polyetylenimine (PEI) er en kationisk polymer som kan transfektere HEK293T-celler med høy effektivitet uten mye cytotoksisitet og har en ubetydelig kostnad sammenlignet med lipofeksjonsbaserte metoder18. I denne situasjonen kan PEI brukes til oppskalerte anvendelser av høy titer LVS-produksjon gjennom konsentrasjon av lentivirale partikler fra kultursupernatanter ved hjelp av forskjellige teknikker. Den presenterte artikkelen beskriver bruken av PEI til å transfektere HEK293T-celler og lentivirale vektorkonsentrasjon ved bruk av ultrasentrifugering gjennom en sukrosepute. Ved hjelp av denne metoden får vi regelmessig titere godt over 5 x 107 IE / ml med lave batch-til-batch-variasjoner. Metoden er enkel, rett frem og kostnadseffektiv for oppskalerte applikasjoner for genlevering til hESCs og hESCs-avledede celler.
Evnen til å genmodifisere stamceller for studier eller kliniske formål er begrenset både av teknologi og grunnleggende forståelse av biologien til hESCs. Teknikker som har vist betydelig potensial i muse-ESC, som fettinfeksjon og elektroporering, er ikke svært effektive for hESCs, som er notorisk vanskelig for genlevering ved konvensjonelle metoder20. Denne oppfatningen har ført til ikke bare optimalisering av eksisterende teknikker, men også utvikling av nye metoder for økt transfeksjonse…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av forskningsstipend fra De forente arabiske emirater University (UAEU), stipend # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) og # 12R010 (UAEU-AUA stipend). Vi takker professor Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) for å hjelpe oss med å redigere manuskriptet for stil og grammatikk.
Alle data er tilgjengelig på forespørsel.
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
XAV 939 | Tocris | 3748/10 |