Entrega mediada lentiviral de shRNAs para hESCs e NPCs usando polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI)

Summary

Usando a polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI), produzimos partículas lentivirais para expressão estável de shRNAs em células-tronco embrionárias humanas H9 (hESCs) e células progenitoras neurais derivadas de H9 (NPCs) com alta eficiência.

Abstract

O protocolo atual descreve o uso de partículas lentivirais para a entrega de RNAs (shRNAs) de grampos curtos (shRNAs) tanto para células-tronco embrionárias humanas (hESCs) quanto células progenitoras neurais (NPCs) derivadas de hESCs com alta eficiência. As partículas lentivirais foram geradas pela co-transfecção de células HEK293T usando vetores de entrada (carregando shRNAs) juntamente com plasmídeos de embalagem (pAX e pMD2.G) usando a polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI). As partículas virais foram concentradas usando ultracentrifugação, o que resultou em titulações médias acima de 5 x 10⁷. Tanto os hESCs quanto os NPCs poderiam ser infectados em alta eficiência usando essas partículas lentivirais, como mostra a seleção de puramicina e expressão estável em hESCs, bem como expressão de GFP transitória em NPCs. Além disso, a análise de manchas ocidentais mostrou uma redução significativa na expressão de genes visados por shRNAs. Além disso, as células mantiveram sua pluripotência, bem como potencial de diferenciação, evidenciado por sua subsequente diferenciação em diferentes linhagens de CNS. O protocolo atual trata da entrega de shRNAs; no entanto, a mesma abordagem poderia ser usada para a expressão ectópica de cDNAs para estudos de superexpressão.

Introduction

As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) derivadas da massa celular interna blastocisto são pluripotentes e podem ser diferenciadas em diferentes tipos de células, dependendo de fatores externos em condições in vitro ^1,2. Para aproveitar totalmente o potencial dos hESCs, é imprescindível ter métodos rápidos e confiáveis de entrega de genes para essas células. Convencionalmente, as técnicas utilizadas podem ser amplamente classificadas em dois tipos: sistemas de entrega de genes não-virais e virais ^3,4. Os sistemas de entrega de genes não-virais mais usados são lipofecção, eletroporação e nucleofeipulação. Os sistemas de entrega não-virais são vantajosos devido à menor inserção de mutações e uma diminuição geral da imunogenicidade ^5,6. No entanto, esses métodos resultam em baixa eficiência de transfecção e curta duração da expressão genética transitória, o que é uma grande limitação para estudos de diferenciação de longo prazo⁷. A eletroporação resulta em melhores eficiências de transfecção em comparação com a lipofecção; no entanto, resulta em mais de 50% de morte celular ^8,9,10. Usando nucleofecção, a eficiência de sobrevivência celular e transfecção pode ser melhorada combinando lipofecção e eletroporação, mas a abordagem precisa de tampões específicos de células e equipamentos especializados e, assim, torna-se bastante cara para aplicações dimensionadas^11,12.

Em contraste, os vetores virais têm mostrado melhores eficiências de transfecção, bem como baixa citotoxicidade geral, após a transdução. Além disso, os genes entregues são expressos de forma estável e, portanto, tornam este método ideal para estudos de longo prazo¹³. Entre os vetores virais mais utilizados para a entrega de genes em hESCs estão vetores lentivirais (LVS), que podem dar mais de 80% de eficiência de transdução usando partículas virais de alta titer^14,15. Lipofecção e precipitação de CaPO₄ estão entre os métodos mais usados para transfectar transitóriamente células HEK293T ou seus derivados com vetores de transferência genética, juntamente com plasmídeos de embalagem para produzir partículas lentivirais¹⁶. Embora a lipofecção resulte em boa eficiência de transfecção e baixa citotoxicidade, a técnica é prejudicada pelo seu custo, e escalar para obter partículas lentivirais de alto título seria muito caro. A precipitação de CaPO₄ resulta em eficiências de transfecção relativamente semelhantes às obtidas por lipofecção. Embora econômica, a precipitação do CaPO₄ resulta em morte celular significativa após transfecções, o que dificulta a padronização e a evitar variações em lote a lote¹⁷. Nesse cenário, desenvolver um método que dê alta eficiência de transfecção, baixa citotoxicidade e custo-benefício é crucial para a produção de partículas lentiviras de alto título para serem utilizadas em hESCs.

Polietilenimina (PEI) é um polímero cationico que pode transfetar células HEK293T em alta eficiência sem muita citotoxicidade e tem um custo insignificante em comparação com os métodos baseados em lipofecção¹⁸. Nesta situação, o PEI pode ser usado para aplicações dimensionadas de alta produção de LVS de titer através da concentração de partículas lentivirais de supernacantes culturais utilizando várias técnicas. O artigo apresentado descreve o uso de PEI para transfetar células HEK293T e concentração de vetores lentiviral usando ultracentrifugação através de uma almofada de sacarose. Usando este método, obtemos regularmente titers bem acima de 5 x 10⁷ UI/mL com variações de lote a lote baixas. O método é simples, direto e econômico para aplicações dimensionadas para entrega de genes em células derivadas de hESCs e hESCs.

Protocol

1. Transfecção de células HEK293T usando pei ou lipofectamina 3000 reagente Cultura HEK293T células em DMEM + 10% FBS + 1x penicilina/estreptomicina a 37 °C em uma incubadora umidificada com atmosfera de 5% DE CO2 e 21% O2 até que sejam 90% confluentes antes de semear para transfecção. Use um número de passagem relativamente baixo de células para alta produção de vírus titer (idealmente menos que P30). Semente 4 x 106 células em 10 mL de …

Representative Results

Após a transferência genética, a alta viabilidade dos hESCs é inevitavelmente necessária. Apesar dos esforços e otimização dos protocolos para reduzir a morte celular após a eletroporação de hESCs, mais de 50% da morte celular ainda é observada após a eletroporação dessas células, juntamente com baixa eficiência de transfecção20. A transferência de genes mediada pela Lentiviral não só resulta em alta eficiência da transferência genética, mas também demonstra altos níveis…

Discussion

A capacidade de modificar geneticamente células-tronco para estudo ou fins clínicos é limitada tanto pela tecnologia quanto pela compreensão básica da biologia dos hESCs. Técnicas que têm mostrado potencial significativo em ESCs de camundongos, como lipofecção e eletroporação, não são altamente eficientes para os hESCs, que são notoriamente difíceis para a entrega de genes pelos métodos convencionais²⁰. Essa noção levou não só à otimização das técnicas existentes, mas tamb?…

Materials

2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10