Lentivirral medierad leverans av shRNA till hESC och NPC med hjälp av billig katjonisk polymerpolyetylenimine (PEI)

Summary

Med hjälp av den billiga katjoniska polymeren polyetylenimin (PEI) producerade vi lentivirala partiklar för stabilt uttryck av shRNA i H9 humana embryonala stamceller (hESCs) och övergående transducerade H9-härledda neurala stamceller (NPC) med hög effektivitet.

Abstract

Det nuvarande protokollet beskriver användningen av lentivirala partiklar för leverans av korta hårnåls-RNA (shRNA) till både mänskliga embryonala stamceller (hESC) och neurala stamceller (NPC) härledda från hESC med hög effektivitet. Lentivirala partiklar genererades genom att samtransfektera HEK293T-celler med hjälp av ingångsvektorer (bärande shRNA) tillsammans med förpackningsplasmider (pAX och pMD2.G) med användning av den billiga katjoniska polymeren polyetylenimine (PEI). Virala partiklar koncentrerades med hjälp av ultracentrifugering, vilket resulterade i genomsnittliga titrar över 5 x 10⁷. Både hESC och NPC kan infekteras med hög effektivitet med hjälp av dessa lentivirala partiklar, vilket framgår av puromycinval och stabilt uttryck i hESC, samt övergående GFP-uttryck i NPC. Dessutom visade western blot-analys en signifikant minskning av uttrycket av gener riktade mot shRNA. Dessutom behöll cellerna sin pluripotens såväl som differentieringspotential, vilket framgår av deras efterföljande differentiering i olika linjer av CNS. Det nuvarande protokollet behandlar leverans av shRNA; samma tillvägagångssätt kan dock användas för ektopiskt uttryck av cDNA för överuttrycksstudier.

Introduction

Mänskliga embryonala stamceller (hESC) som härrör från blastocystens inre cellmassa är pluripotenta och kan differentieras till olika celltyper beroende på yttre faktorer under in vitro-förhållanden ^1,2. För att fullt ut utnyttja potentialen hos hESC är det absolut nödvändigt att ha snabba och pålitliga genleveransmetoder för dessa celler. Konventionellt kan de använda teknikerna i stort sett klassificeras i två typer: icke-virala och virala genleveranssystem ^3,4. De vanligaste icke-bilaterala genleveranssystemen är lipofektion, elektroporering och nukleofektion. Icke-dödliga leveranssystem är fördelaktiga på grund av färre insättningsmutationer och en total minskning av immunogeniciteten ^5,6. Dessa metoder resulterar dock i låg transfektionseffektivitet och en kort varaktighet av övergående genuttryck, vilket är en stor begränsning för långsiktiga differentieringsstudier⁷. Elektroporering resulterar i bättre transfektionseffektivitet jämfört med lipofektion; det resulterar dock i mer än 50% celldöd ^8,9,10. Med hjälp av nukleofsektion kan cellöverlevnad och transfektionseffektivitet förbättras genom att kombinera lipofektion och elektroporering, men tillvägagångssättet behöver cellspecifika buffertar och specialutrustning och blir därmed ganska kostsamt för uppskalade applikationer^11,12.

Däremot har virala vektorer visat förbättrad transfektionseffektivitet, liksom övergripande låg cytotoxicitet, efter transduktion. Dessutom är de levererade generna stabilt uttryckta och gör därför denna metod idealisk för långtidsstudier¹³. Bland de vanligaste virusvektorerna för genleverans till hESC är lentivirala vektorer (LVS), vilket kan ge mer än 80% transduktionseffektivitet med hjälp av viruspartiklar med hög titer ^14,15. Lipofektion och CaPO 4-utfällning är bland de vanligaste metoderna för att övergående transfektera HEK293T-celler eller dess derivat med genöverföringsvektorer tillsammans med förpackningsplasmider för att ge lentivirala partiklar¹⁶. Även om lipofektion resulterar i god transfektionseffektivitet och låg cytotoxicitet, hindras tekniken av dess kostnad, och att skala upp för att få höga titer lentivirala partiklar skulle vara mycket kostsamt. CaPO 4-utfällning resulterar i relativt liknande transfektionseffektivitet som de som erhålls med lipofektion. Även om det är kostnadseffektivt resulterar CaPO_4-nederbörd i betydande celldöd efter transfektioner, vilket gör det svårt att standardisera och undvika batch-till-batch-variationer¹⁷. I detta scenario är det avgörande att utveckla en metod som ger hög transfektionseffektivitet, låg cytotoxicitet och kostnadseffektivitet för produktionen av hög titer lentivirala partiklar som ska användas i hESC.

Polyetylenimin (PEI) är en katjonisk polymer som kan transfektera HEK293T-celler med hög effektivitet utan mycket cytotoxicitet och har en försumbar kostnad jämfört med lipofektionsbaserade metoder¹⁸. I denna situation kan PEI användas för uppskalade applikationer av LVS-produktion med hög titer genom koncentrationen av lentivirala partiklar från odlingssupnatanter med hjälp av olika tekniker. Den presenterade artikeln beskriver användningen av PEI för att transfektera HEK293T-celler och lentivirral vektorkoncentration med hjälp av ultracentrifugering genom en sackaroskudde. Med hjälp av denna metod får vi regelbundet titrar långt över 5 x 10⁷ IE / ml med låga batch-till-batch-variationer. Metoden är enkel, okomplicerad och kostnadseffektiv för uppskalade applikationer för genleverans till hESCs och hESCs-härledda celler.

Protocol

1. Transfektion av HEK293T-celler med antingen PEI- eller Lipofectamine 3000-reagens Odla HEK293T-celler i DMEM + 10% FBS + 1x penicillin / streptomycin vid 37 ° C i en fuktad inkubator med en atmosfär av 5% CO2 och 21%O2 tills de är 90% sammanflytande före sådd för transfektion. Använd ett relativt lågt passageantal celler för hög titervirusproduktion (helst mindre än P30). Frö 4 x 106 celler i 10 ml fullständigt tillväxtmedium i en 100 …

Representative Results

Efter genöverföring krävs oundvikligen hög livskraft hos hESC. Trots ansträngningar och optimering av protokoll för att minska celldöd efter elektroporering av hESC observeras fortfarande mer än 50% celldöd efter elektroporering av dessa celler, tillsammans med låg transfektionseffektivitet20. Lentivirral medierad genöverföring resulterar inte bara i hög effektivitet av genöverföring utan visar också höga nivåer av cellviabilitet efter transduktion. Resultaten nedan presenterar t…

Discussion

Förmågan att genetiskt modifiera stamceller för studier eller kliniska ändamål begränsas både av teknik och den grundläggande förståelsen för hESCs biologi. Tekniker som har visat betydande potential i mus-ESC, som lipofektion och elektroporering, är inte särskilt effektiva för hESC, som är notoriskt svåra för genleverans med konventionella metoder²⁰. Denna uppfattning har lett till inte bara optimering av befintliga tekniker utan också utveckling av nya metoder för ökad transf…

Materials

2-Mercaptoethanol	Invitrogen	31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes	Beckman Coulter	C14292
Accutase	Stem Cell Technologies	7920
bFGF Recombinant human	Invitrogen	PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V	Invitrogen	15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free	Corning	354234
Cyclopamine	Stem Cell Technologies	72074
DMEM media	Invitrogen	11995073
DMEM Nutrient mix F12	Invitrogen	11320033
DPBS w/o: Ca and Mg	PAN Biotech	P04-36500
Fetal bovie serum	Invitrogen	10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody	CST	2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent	Stem Cell Technologies	7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution	GE healthcare	SH30238.01
L Glutamine, 100X	Invitrogen	2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody	Proteintech	15707-1-AP
L2HGDH shRNA	Macrogen		Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher	L3000001
mTesR1 complete media	Stem Cell Technologies	85850
Neurobasal medium 1X CTS	Invitrogen	A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x	PAN Biotech	P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x	PAN Biotech	P07-07200
Penicillin streptomycin SOL	Invitrogen	15140122
pLKO.1 TRC vector	Addgene	10878
pLL3.7 vector	Addgene	11795
pMD2.G	Addgene	12259
Polybrene infection reagent	Sigma	TR1003- G
Polyethylenimine, branched	Sigma	408727
psPAX2.0	Addgene	12260
Purmorphamine	Tocris	4551/10
Puromycin	Invitrogen	A1113802
ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254
SB 431542	Tocris	1614/10
Trypsin .05% EDTA	Invitrogen	25300062
XAV 939	Tocris	3748/10