زرع شبكية العين للفأر البالغ شبكية العين كنموذج خارج الجسم الحي لدراسة أمراض الأوعية الدموية العصبية في الشبكية

Summary

يقدم هذا البروتوكول ويصف خطوات عزل وتشريح وزراعة وتلطيخ نباتات الشبكية التي تم الحصول عليها من فأر بالغ. هذه الطريقة مفيدة كنموذج خارج الجسم الحي لدراسة أمراض الأوعية الدموية العصبية المختلفة في شبكية العين مثل اعتلال الشبكية السكري.

Abstract

أحد التحديات في أبحاث شبكية العين هو دراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة مثل الخلايا العصبية في شبكية العين والخلايا الدبقية والخلايا الوعائية. إن عزل الخلايا العصبية الشبكية وزراعتها والحفاظ عليها في المختبر لها قيود تقنية وبيولوجية. قد تتغلب زراعة نباتات الشبكية على هذه القيود وتقدم نموذجا فريدا خارج الجسم الحي لدراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة مع معلمات كيميائية حيوية يتم التحكم فيها جيدا ومستقلة عن نظام الأوعية الدموية. علاوة على ذلك ، تعد زراعة الشبكية أداة فحص فعالة لدراسة التدخلات الدوائية الجديدة في مختلف أمراض الأوعية الدموية والأمراض التنكسية العصبية في شبكية العين مثل اعتلال الشبكية السكري. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لعزل وزراعة نباتات الشبكية لفترة طويلة. تعرض المخطوطة أيضا بعض المشكلات الفنية أثناء هذا الإجراء والتي قد تؤثر على النتائج المرجوة وقابلية استنساخ مزرعة زراعة الشبكية. أظهر التلوين المناعي للأوعية الشبكية والخلايا الدبقية والخلايا العصبية الشعيرات الدموية الشبكية السليمة والخلايا العصبية بعد 2 أسابيع من بداية ثقافة زراعة الشبكية. هذا يؤسس لزرع الشبكية كأداة موثوقة لدراسة التغيرات في الأوعية الدموية في شبكية العين والخلايا العصبية في ظل ظروف تحاكي أمراض الشبكية مثل اعتلال الشبكية السكري.

Introduction

تم تقديم نماذج مختلفة لدراسة أمراض الشبكية ، بما في ذلك النماذج في الجسم الحي وفي المختبر. لا يزال استخدام الحيوانات في البحث مسألة نقاش أخلاقي ومتعدي مستمر¹. تستخدم النماذج الحيوانية التي تنطوي على القوارض مثل الفئران أو الجرذان بشكل شائع في أبحاث شبكية العين²،^3،4. ومع ذلك ، فقد نشأت مخاوف سريرية بسبب الوظائف الفسيولوجية المختلفة لشبكية العين في القوارض مقارنة بالبشر ، مثل غياب البقعة أو الاختلافات في رؤية الألوان⁵. كما أن استخدام عيون ما بعد الوفاة البشرية لأبحاث الشبكية له العديد من المشاكل ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر الاختلافات في الخلفيات الجينية للعينات الأصلية ، والتاريخ الطبي للمتبرعين ، والبيئات أو أنماط الحياة السابقة للمتبرعين⁶. علاوة على ذلك ، فإن استخدام النماذج في المختبر في أبحاث الشبكية له بعض العيوب أيضا. تشمل نماذج زراعة الخلايا المستخدمة لدراسة أمراض الشبكية استخدام خطوط الخلايا ذات الأصل البشري أو الخلايا الأولية أو الخلايا الجذعية⁷. لقد ثبت أن نماذج زراعة الخلايا المستخدمة تعاني من مشاكل من حيث كونها ملوثة أو غير محددة بشكل خاطئ أو غير متمايزة⁸،⁹،^10،11. في الآونة الأخيرة ، أظهرت تقنية الشبكية العضوية تقدما كبيرا. ومع ذلك ، فإن بناء شبكية العين المعقدة للغاية في المختبر له العديد من القيود. على سبيل المثال ، لا تتمتع عضويات الشبكية بنفس الخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية الناضجة في شبكية العين الحية. للتغلب على هذا القيد ، يجب أن تدمج تقنية الشبكية العضوية المزيد من الميزات البيولوجية والخلوية ، بما في ذلك خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية والخلايا المناعية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة¹²،^13،14،15.

ظهرت نباتات الشبكية العضوية كأداة موثوقة لدراسة أمراض الشبكية مثل اعتلال الشبكية السكري وأمراض الشبكية التنكسية¹⁶،¹⁷،^18،19. بالمقارنة مع التقنيات الأخرى الموجودة ، فإن استخدام نباتات الشبكية يدعم كلا من مزارع خلايا الشبكية في المختبر وكذلك النماذج الحيوانية الحالية في الجسم الحي عن طريق إضافة ميزة فريدة لدراسة الحديث المتبادل بين خلايا الشبكية المختلفة تحت نفس المعلمات البيوكيميائية ومستقلة عن المتغيرات الجهازية. تسمح مزارع explant بالاحتفاظ بخلايا شبكية مختلفة معا في نفس البيئة ، مما يسمح بالحفاظ على تفاعلات شبكية العين بين الخلايا²⁰،^21،22. علاوة على ذلك ، أظهرت دراسة سابقة أن نباتات الشبكية كانت قادرة على الحفاظ على البنية المورفولوجية ووظائف خلايا الشبكية المستزرعة²³. وبالتالي ، يمكن أن توفر نباتات الشبكية منصة لائقة للتحقيق في الأهداف العلاجية المحتملة لمجموعة واسعة من أمراض الشبكية²⁴،^25،26. توفر مزارع زراعة الشبكية تقنية يمكن التحكم فيها وهي بديل مرن للغاية لل mothods الموجودة التي تسمح بالعديد من التلاعب الدوائي ويمكن أن تكشف عن العديد من الآليات الجزيئية²⁷.

الهدف العام من هذه الورقة هو تقديم تقنية زراعة الشبكية كنظام نموذج وسيط معقول بين مزارع الخلايا في المختبر والنماذج الحيوانية في الجسم الحي . يمكن لهذه التقنية محاكاة وظائف الشبكية بطريقة أفضل من الخلايا المنفصلة. نظرا لأن طبقات الشبكية المختلفة تظل سليمة ، يمكن تقييم التفاعلات بين الخلايا في الشبكية في المختبر في ظل ظروف كيميائية حيوية يتم التحكم فيها جيدا ومستقلة عن عمل نظام الأوعية الدموية²⁸.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) في جامعة أوكلاند ، روتشستر ، ميتشيغن ، الولايات المتحدة الأمريكية واتبعت الإرشادات التي وضعتها جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) بيان لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. <p class="jove_titl…

Representative Results

بقاء الخلايا العصبية والأوعية الدموية في الشبكية في الشبكية في المزرعة خارج الجسم الحي لفترة طويلةمن خلال زراعة نبات شبكية العين باستخدام بروتوكولنا ، نجحنا في الحفاظ على خلايا شبكية مختلفة كانت قابلة للحياة لمدة تصل إلى 2 أسابيع. للتحقق من وجود خلايا ش?…

Discussion

يدرس مختبرنا التغيرات الفيزيولوجية المرضية التي تعزز ضعف الأوعية الدموية الدقيقة في شبكية العين لسنوات³¹،32،33،34،^35،36. تعد زراعة الشبكية إحدى التقنيات التي يمكن أن تكون ذات قيمة كبي…

Materials

Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407