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Médecine

망막 신경혈관 질환 연구를 위한 생체 외 모델로서의 성인 마우스 망막의 망막 외 이식편

Published: December 09, 2022
doi:
10.3791/63966
, ,
1Eye Research Center and Department of Foundational Medical Studies,Oakland University William Beaumont School of Medicine, 2Eye Research Institute,Oakland University, 3Human Anatomy and Embryology Department, Mansoura Faculty of Medicine,Mansoura University

Summary

이 프로토콜은 성인 마우스로부터 수득한 망막 외식편의 분리, 해부, 배양 및 염색을 위한 단계를 제시하고 설명한다. 이 방법은 당뇨병 성 망막증과 같은 다양한 망막 신경 혈관 질환을 연구하기위한 생체 외 모델로서 유익합니다.

Abstract

망막 연구의 과제 중 하나는 망막 뉴런, 신경교 세포 및 혈관 세포와 같은 서로 다른 망막 세포 간의 혼선을 연구하는 것입니다. 시험관 내에서 망막 뉴런을 분리, 배양 및 유지하는 것은 기술적, 생물학적 한계가 있습니다. 망막 체외이식편을 배양하면 이러한 한계를 극복하고 잘 제어된 생화학적 매개변수를 가지고 있고 혈관계와 무관하게 다양한 망막 세포 간의 혼선을 연구할 수 있는 고유한 생체 외 모델을 제공할 수 있습니다. 또한, 망막 체외이식편은 당뇨병성 망막병증과 같은 다양한 망막 혈관 및 신경퇴행성 질환에 대한 새로운 약리학적 개입을 연구하기 위한 효과적인 스크리닝 도구입니다. 여기에서는 망막 체외이식편의 분리 및 장기간 배양을 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 원고는 또한이 절차 동안 망막 체외 이식편 배양의 원하는 결과와 재현성에 영향을 미칠 수있는 기술적 문제 중 일부를 제시합니다. 망막 혈관, 신경교 세포 및 뉴런의 면역 염색은 망막 체외이식편 배양 시작으로부터 2주 후에 손상되지 않은 망막 모세혈관 및 신경교세포를 입증했습니다. 이것은 망막 외식편을 당뇨병성 망막병증과 같은 망막 질환을 모방하는 조건에서 망막 혈관 및 신경교세포의 변화를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 도구로 설정합니다.

Introduction

생체 내 및 시험관 내 모델 모두를 포함하여 망막 질환을 연구하기 위해 다양한 모델이 제시되었습니다. 연구에서 동물의 사용은 여전히 지속적인 윤리적 및 번역 적 논쟁의 문제입니다1. 생쥐 또는 쥐와 같은 설치류를 포함하는 동물 모델은 망막 연구 2,3,4에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나 황반의 부재 또는 색각의 차이와 같이 인간과 비교하여 설치류에서 망막의 생리적 기능이 다르기 때문에 임상 적 문제가 발생했습니다5. 망막 연구를 위한 인간 사후 눈의 사용은 또한 원본 샘플의 유전적 배경, 기증자의 병력, 기증자의 이전 환경 또는 생활 방식의 차이를 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 문제를 가지고있습니다6. 또한 망막 연구에서 체외 모델을 사용하는 데에도 몇 가지 단점이 있습니다. 망막 질환을 연구하기 위해 사용되는 세포 배양 모델에는 인간 기원의 세포주, 일차 세포 또는줄기 세포의 활용이 포함됩니다7. 사용된 세포 배양 모델은 오염, 오식별 또는 역분화 측면에서 문제가 있는 것으로 나타났습니다 8,9,10,11. 최근 망막 오가노이드 기술은 상당한 발전을 보이고 있습니다. 그러나 시험관 내에서 매우 복잡한 망막의 구성에는 몇 가지 한계가 있습니다. 예를 들어, 망막 오가노이드는 성숙한 생체 내 망막과 동일한 생리학적 및 생화학적 특성을 갖지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 망막 오가노이드 기술은 평활근 세포, 혈관 및 미세아교세포12,13,14,15와 같은 면역 세포를 포함하여 더 많은 생물학적 및 세포 기능을 통합해야 합니다.

기관형 망막 외식편은 당뇨병성 망막증 및 퇴행성 망막 질환16,17,18,19와 같은 망막 질환을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 도구로 부상했습니다. 기존의 다른 기술과 비교하여 망막 체외이식편의 사용은 동일한 생화학적 매개변수 하에서 전신 변수와 무관하게 다양한 망막 세포 간의 혼선을 연구하는 고유한 기능을 추가하여 체외 망막 세포 배양과 현재의 생체 내 동물 모델을 모두 지원합니다. 체외이식편 배양은 상이한 망막 세포가 동일한 환경에서 함께 유지되도록 하여 망막 세포간 상호작용의 보존을 가능하게 한다(20,21,22). 더욱이, 이전의 연구는 망막 체외이식편이 배양된 망막 세포의 형태학적 구조 및 기능성을 보존할 수 있음을 보여주었다(23). 따라서, 망막 외식편은 매우 다양한 망막 질환에 대한 가능한 치료 표적을 조사하기 위한 적절한 플랫폼을 제공할 수 있다(24,25,26). 망막 체외이식편 배양은 제어 가능한 기술을 제공하며 수많은 약리학적 조작을 허용하고 여러 분자 메커니즘을 밝힐 수 있는 기존 모토드에 대한 매우 유연한 대체물입니다27.

이 논문의 전반적인 목표는 망막 체외 이식편 기술을 시험관 내 세포 배양과 생체 내 동물 모델 사이의 합리적인 중간 모델 시스템으로 제시하는 것입니다. 이 기술은 해리 된 세포보다 더 나은 방식으로 망막 기능을 모방 할 수 있습니다. 다양한 망막 층이 손상되지 않은 상태로 유지됨에 따라 망막 세포 간 상호 작용은 잘 제어 된 생화학 적 조건 하에서 실험실에서 평가할 수 있으며 혈관계 기능과 무관하게 평가할 수 있습니다28.

Protocol

모든 동물 실험은 미국 미시건 주 로체스터에있는 오클랜드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았으며 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서에서 제정 한 지침을 따랐습니다. 1. 동물 준비 빛이 조절되는 환경에서 동물을 일정한 온도로 보관하십시오. 동물 사육실의 온도 설정은 “실험실 동물의 …

Representative Results

생체 외 배양 배지에서 망막 외식편의 신경 및 혈관 망막 세포의 생존 연장 시간우리의 프로토콜을 사용하여 망막 체외이식편을 배양함으로써 우리는 최대 2주 동안 생존할 수 있는 다양한 망막 세포를 유지하는 데 성공했습니다. 상이한 망막 세포의 존재를 확인하기 위해, 신경 세포 마커 (NeuN), 신경교 세포 마커 (GFAP) 및 혈관 마커 (isolectin-B4)를 ?…

Discussion

우리 연구실은31,32,33,34,35,36 년 동안 망막 미세 혈관 기능 장애를 촉진하는 병태 생리 학적 변화를 연구 해 왔습니다. 망막 외식편은 당뇨병성 망막증이나 퇴행성 망막질환과 같은 망막 질환을 연구하기 위한 모델로 사용하기에 큰 가치가 있는 기술…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

국립 안과 연구소 (R01 EY030054)에 대한 국립 보건원 (NIH) 기금 보조금을 Mohamed Al-Shabrawey 박사에게 감사드립니다. 비디오 내레이션을 도와 주신 Kathy Wolosiewicz에게 감사드립니다. 수술용 현미경 사용 및 기록 중에 도움을 주신 오클랜드 대학교 안과 연구소 소아 망막 연구소의 Ken Mitton 박사에게 감사드립니다. 이 비디오는 Khaled Elmasry 박사가 편집하고 감독했습니다.

Materials

Adult C57Bl/6J mice  The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA 664
All-in-One Fluorescence Microscope  KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. BZ-X800
B27 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17504-04
Blockade blocking solution  Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA B10710
DMEM F12 Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG. Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin) Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades World Precision Instruments,FL 34240, USA  Straight (503365)
N2 supplements Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 140652
Paraformaldehyde 4% in PBS BBP, Ashland, MA, 01721 USA C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA 15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody Abcam.,Cambridge, UK ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. Z0334
Texas Red Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA SA-5006-1
TritonX BioRad Hercules, CA,  94547,USA 1610407
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Keywords: Retinal ExplantEx Vivo ModelRetinal Neurovascular DiseasesRetinal NeuronsGlial CellsVascular CellsDiabetic RetinopathyRetinal DysfunctionMouse RetinaRetinal DissectionRetinal Culture
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Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases. J. Vis. Exp. (190), e63966, doi:10.3791/63966 (2022).
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