Explant rétinien de la rétine de souris adulte comme modèle ex vivo pour l’étude des maladies neurovasculaires rétiniennes

Summary

Ce protocole présente et décrit les étapes pour l’isolement, la dissection, la culture et la coloration des explants rétiniens obtenus à partir d’une souris adulte. Cette méthode est bénéfique comme modèle ex vivo pour étudier différentes maladies neurovasculaires rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique.

Abstract

L’un des défis de la recherche sur la rétine est d’étudier la diaphonie entre différentes cellules rétiniennes telles que les neurones rétiniens, les cellules gliales et les cellules vasculaires. L’isolement, la culture et le maintien des neurones rétiniens in vitro ont des limites techniques et biologiques. La culture d’explants rétiniens peut surmonter ces limitations et offrir un modèle ex vivo unique pour étudier la diaphonie entre diverses cellules rétiniennes avec des paramètres biochimiques bien contrôlés et indépendants du système vasculaire. De plus, les explants rétiniens sont un outil de dépistage efficace pour étudier de nouvelles interventions pharmacologiques dans diverses maladies vasculaires et neurodégénératives rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’isolement et la culture des explants rétiniens pendant une période prolongée. Le manuscrit présente également certains des problèmes techniques au cours de cette procédure qui peuvent affecter les résultats souhaités et la reproductibilité de la culture d’explant rétinien. L’immunomarquage des vaisseaux rétiniens, des cellules gliales et des neurones a démontré des capillaires rétiniens et des cellules neurogliales intacts après 2 semaines à compter du début de la culture d’explantation rétinienne. Cela établit les explants rétiniens comme un outil fiable pour étudier les changements dans le système vasculaire rétinien et les cellules neurogliales dans des conditions qui imitent les maladies rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique.

Introduction

Différents modèles ont été présentés pour étudier les maladies de la rétine, y compris des modèles in vivo et in vitro. L’utilisation des animaux dans la recherche fait encore l’objet d’un débat éthique et translationnel^{continu 1}. Les modèles animaux impliquant des rongeurs tels que les souris ou les rats sont couramment utilisés dans la recherche rétinienne ^2,3,4. Cependant, des préoccupations cliniques sont apparues en raison des différentes fonctions physiologiques de la rétine chez les rongeurs par rapport aux humains, telles que l’absence de la macula ou les différences de vision des couleurs⁵. L’utilisation d’yeux post-mortem humains pour la recherche rétinienne présente également de nombreux problèmes, y compris, mais sans s’y limiter, des différences dans les antécédents génétiques des échantillons originaux, les antécédents médicaux des donneurs et les environnements ou modes de vie antérieurs des donneurs⁶. En outre, l’utilisation de modèles in vitro dans la recherche rétinienne présente également certains inconvénients. Les modèles de culture cellulaire utilisés pour étudier les maladies de la rétine comprennent l’utilisation de lignées cellulaires d’origine humaine, de cellules primaires ou de cellules souches⁷. Il a été démontré que les modèles de culture cellulaire utilisés ont des problèmes en termes de contamination, d’identification erronée ou de dédifférenciation 8,9,10,11. Récemment, la technologie organoïde rétinienne a montré des progrès significatifs. Cependant, la construction de rétines très complexes in vitro présente plusieurs limites. Par exemple, les organoïdes rétiniens n’ont pas les mêmes caractéristiques physiologiques et biochimiques que les rétines in vivo matures. Pour surmonter cette limitation, la technologie organoïde rétinienne doit intégrer davantage de caractéristiques biologiques et cellulaires, y compris les cellules musculaires lisses, le système vasculaire et les cellules immunitaires comme la microglie ^12,13,14,15.

Les explants organotypiques de la rétine sont apparus comme un outil fiable pour étudier les maladies rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique et les maladies dégénératives de la rétine^16,17,18,19. Par rapport à d’autres techniques existantes, l’utilisation d’explants rétiniens soutient à la fois les cultures cellulaires rétiniennes in vitro et les modèles animaux in vivo actuels en ajoutant une caractéristique unique pour étudier la diaphonie entre diverses cellules rétiniennes sous les mêmes paramètres biochimiques et indépendamment des variables systémiques. Les cultures d’explantation permettent de maintenir différentes cellules rétiniennes ensemble dans le même environnement, permettant la préservation des interactions intercellulaires rétiniennes^20,21,22. De plus, une étude antérieure a montré que les explants rétiniens étaient capables de préserver la structure morphologique et la fonctionnalité des cellules rétiniennes en culture²³. Ainsi, les explants rétiniens peuvent fournir une plate-forme décente pour étudier des cibles thérapeutiques possibles pour une grande variété de maladies rétiniennes^24,25,26. Les cultures d’explants rétiniens fournissent une technique contrôlable et sont un substitut très flexible aux motos existantes qui permettent de nombreuses manipulations pharmacologiques et peuvent découvrir plusieurs mécanismes moléculaires²⁷.

L’objectif global de cet article est de présenter la technique de l’explant rétinien comme un système de modèle intermédiaire raisonnable entre les cultures cellulaires in vitro et les modèles animaux in vivo . Cette technique peut imiter les fonctions rétiniennes d’une meilleure manière que les cellules dissociées. Comme diverses couches rétiniennes restent intactes, les interactions intercellulaires rétiniennes peuvent être évaluées en laboratoire dans des conditions biochimiques bien contrôlées et indépendamment du fonctionnement du système vasculaire²⁸.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université d’Oakland, Rochester, MI, États-Unis et ont suivi les lignes directrices établies par la Déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle. 1. Préparation des animaux Gardez les animaux logés sous une température const…

Representative Results

Survie des cellules rétiniennes neuronales et vasculaires de l’explant rétinien dans des milieux de culture ex vivo pendant une période prolongéeEn cultivant un explant rétinien en utilisant notre protocole, nous avons réussi à maintenir différentes cellules rétiniennes viables jusqu’à 2 semaines. Pour vérifier la présence de différentes cellules rétiniennes, une coloration par immunofluorescence de l’explant rétinien à l’aide d’un …

Discussion

Notre laboratoire étudie les changements physiopathologiques qui favorisent le dysfonctionnement microvasculaire rétinien depuis les années 31,32,33,34,35,36. Les explants rétiniens sont l’une des techniques qui peuvent être d’une grande valeur à utiliser comme modèle pour étudier les maladies rétiniennes telles …

Materials

Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407