Ce protocole présente et décrit les étapes pour l’isolement, la dissection, la culture et la coloration des explants rétiniens obtenus à partir d’une souris adulte. Cette méthode est bénéfique comme modèle ex vivo pour étudier différentes maladies neurovasculaires rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique.
L’un des défis de la recherche sur la rétine est d’étudier la diaphonie entre différentes cellules rétiniennes telles que les neurones rétiniens, les cellules gliales et les cellules vasculaires. L’isolement, la culture et le maintien des neurones rétiniens in vitro ont des limites techniques et biologiques. La culture d’explants rétiniens peut surmonter ces limitations et offrir un modèle ex vivo unique pour étudier la diaphonie entre diverses cellules rétiniennes avec des paramètres biochimiques bien contrôlés et indépendants du système vasculaire. De plus, les explants rétiniens sont un outil de dépistage efficace pour étudier de nouvelles interventions pharmacologiques dans diverses maladies vasculaires et neurodégénératives rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique. Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’isolement et la culture des explants rétiniens pendant une période prolongée. Le manuscrit présente également certains des problèmes techniques au cours de cette procédure qui peuvent affecter les résultats souhaités et la reproductibilité de la culture d’explant rétinien. L’immunomarquage des vaisseaux rétiniens, des cellules gliales et des neurones a démontré des capillaires rétiniens et des cellules neurogliales intacts après 2 semaines à compter du début de la culture d’explantation rétinienne. Cela établit les explants rétiniens comme un outil fiable pour étudier les changements dans le système vasculaire rétinien et les cellules neurogliales dans des conditions qui imitent les maladies rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique.
Différents modèles ont été présentés pour étudier les maladies de la rétine, y compris des modèles in vivo et in vitro. L’utilisation des animaux dans la recherche fait encore l’objet d’un débat éthique et translationnelcontinu 1. Les modèles animaux impliquant des rongeurs tels que les souris ou les rats sont couramment utilisés dans la recherche rétinienne 2,3,4. Cependant, des préoccupations cliniques sont apparues en raison des différentes fonctions physiologiques de la rétine chez les rongeurs par rapport aux humains, telles que l’absence de la macula ou les différences de vision des couleurs5. L’utilisation d’yeux post-mortem humains pour la recherche rétinienne présente également de nombreux problèmes, y compris, mais sans s’y limiter, des différences dans les antécédents génétiques des échantillons originaux, les antécédents médicaux des donneurs et les environnements ou modes de vie antérieurs des donneurs6. En outre, l’utilisation de modèles in vitro dans la recherche rétinienne présente également certains inconvénients. Les modèles de culture cellulaire utilisés pour étudier les maladies de la rétine comprennent l’utilisation de lignées cellulaires d’origine humaine, de cellules primaires ou de cellules souches7. Il a été démontré que les modèles de culture cellulaire utilisés ont des problèmes en termes de contamination, d’identification erronée ou de dédifférenciation 8,9,10,11. Récemment, la technologie organoïde rétinienne a montré des progrès significatifs. Cependant, la construction de rétines très complexes in vitro présente plusieurs limites. Par exemple, les organoïdes rétiniens n’ont pas les mêmes caractéristiques physiologiques et biochimiques que les rétines in vivo matures. Pour surmonter cette limitation, la technologie organoïde rétinienne doit intégrer davantage de caractéristiques biologiques et cellulaires, y compris les cellules musculaires lisses, le système vasculaire et les cellules immunitaires comme la microglie 12,13,14,15.
Les explants organotypiques de la rétine sont apparus comme un outil fiable pour étudier les maladies rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique et les maladies dégénératives de la rétine16,17,18,19. Par rapport à d’autres techniques existantes, l’utilisation d’explants rétiniens soutient à la fois les cultures cellulaires rétiniennes in vitro et les modèles animaux in vivo actuels en ajoutant une caractéristique unique pour étudier la diaphonie entre diverses cellules rétiniennes sous les mêmes paramètres biochimiques et indépendamment des variables systémiques. Les cultures d’explantation permettent de maintenir différentes cellules rétiniennes ensemble dans le même environnement, permettant la préservation des interactions intercellulaires rétiniennes20,21,22. De plus, une étude antérieure a montré que les explants rétiniens étaient capables de préserver la structure morphologique et la fonctionnalité des cellules rétiniennes en culture23. Ainsi, les explants rétiniens peuvent fournir une plate-forme décente pour étudier des cibles thérapeutiques possibles pour une grande variété de maladies rétiniennes24,25,26. Les cultures d’explants rétiniens fournissent une technique contrôlable et sont un substitut très flexible aux motos existantes qui permettent de nombreuses manipulations pharmacologiques et peuvent découvrir plusieurs mécanismes moléculaires27.
L’objectif global de cet article est de présenter la technique de l’explant rétinien comme un système de modèle intermédiaire raisonnable entre les cultures cellulaires in vitro et les modèles animaux in vivo . Cette technique peut imiter les fonctions rétiniennes d’une meilleure manière que les cellules dissociées. Comme diverses couches rétiniennes restent intactes, les interactions intercellulaires rétiniennes peuvent être évaluées en laboratoire dans des conditions biochimiques bien contrôlées et indépendamment du fonctionnement du système vasculaire28.
Notre laboratoire étudie les changements physiopathologiques qui favorisent le dysfonctionnement microvasculaire rétinien depuis les années 31,32,33,34,35,36. Les explants rétiniens sont l’une des techniques qui peuvent être d’une grande valeur à utiliser comme modèle pour étudier les maladies rétiniennes telles …
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier le National Institute of Health (NIH) Funding Grant au National Eye Institute (R01 EY030054) au Dr Mohamed Al-Shabrawey. Nous tenons à remercier Kathy Wolosiewicz de nous avoir aidés avec la narration vidéo. Nous tenons à remercier le Dr Ken Mitton du laboratoire de recherche rétinienne pédiatrique de l’Institut de recherche sur l’œil de l’Université d’Oakland pour son aide lors de l’utilisation du microscope chirurgical et de l’enregistrement. Cette vidéo a été montée et réalisée par le Dr Khaled Elmasry.
Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |