Retinale explant van het netvlies van de volwassen muis als een ex vivo model voor het bestuderen van retinale neurovasculaire ziekten

Summary

Dit protocol presenteert en beschrijft stappen voor de isolatie, dissectie, kweek en kleuring van retinale explantaten verkregen van een volwassen muis. Deze methode is gunstig als een ex vivo model voor het bestuderen van verschillende retinale neurovasculaire ziekten zoals diabetische retinopathie.

Abstract

Een van de uitdagingen in netvliesonderzoek is het bestuderen van de cross-talk tussen verschillende retinale cellen zoals retinale neuronen, gliacellen en vasculaire cellen. Het isoleren, cultiveren en onderhouden van retinale neuronen in vitro hebben technische en biologische beperkingen. Het kweken van retinale explantaten kan deze beperkingen overwinnen en een uniek ex vivo model bieden om de cross-talk tussen verschillende retinale cellen te bestuderen met goed gecontroleerde biochemische parameters en onafhankelijk van het vasculaire systeem. Bovendien zijn retinale explantaten een effectief screeningsinstrument voor het bestuderen van nieuwe farmacologische interventies bij verschillende retinale vasculaire en neurodegeneratieve ziekten zoals diabetische retinopathie. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en cultuur van retinale explantaten voor een langere periode. Het manuscript presenteert ook enkele van de technische problemen tijdens deze procedure die de gewenste resultaten en reproduceerbaarheid van de retinale explantcultuur kunnen beïnvloeden. De immunostaining van de retinale vaten, gliacellen en neuronen toonde intacte retinale haarvaten en neurogliale cellen na 2 weken vanaf het begin van de retinale explantcultuur. Dit stelt retinale explantaten vast als een betrouwbaar hulpmiddel voor het bestuderen van veranderingen in de retinale vasculatuur en neurogliale cellen onder omstandigheden die retinale ziekten zoals diabetische retinopathie nabootsen.

Introduction

Er zijn verschillende modellen gepresenteerd om retinale ziekten te bestuderen, waaronder zowel in vivo als in vitro modellen. Het gebruik van dieren in onderzoek is nog steeds een kwestie van voortdurend ethisch en translationeel debat¹. Diermodellen met knaagdieren zoals muizen of ratten worden vaak gebruikt in netvliesonderzoek ^2,3,4. Er zijn echter klinische zorgen ontstaan vanwege de verschillende fysiologische functies van het netvlies bij knaagdieren in vergelijking met mensen, zoals de afwezigheid van de macula of verschillen in kleurenzicht⁵. Het gebruik van menselijke postmortale ogen voor retinaal onderzoek heeft ook veel problemen, waaronder maar niet beperkt tot verschillen in de genetische achtergronden van de originele monsters, de medische geschiedenis van de donoren en de eerdere omgevingen of levensstijlen van de donoren⁶. Bovendien heeft het gebruik van in vitro modellen in retinaal onderzoek ook enkele nadelen. Celkweekmodellen die worden gebruikt om retinale ziekten te bestuderen, omvatten het gebruik van cellijnen van menselijke oorsprong, primaire cellen of stamcellen⁷. Van de gebruikte celkweekmodellen is aangetoond dat ze problemen hebben in termen van besmet, verkeerd geïdentificeerd of gededifferentieerd^zijn 8,9,10,11. Onlangs heeft retinale organoïde technologie aanzienlijke vooruitgang laten zien. De constructie van zeer complexe netvliezen in vitro heeft echter verschillende beperkingen. Retinale organoïden hebben bijvoorbeeld niet dezelfde fysiologische en biochemische kenmerken als volwassen in vivo netvliezen. Om deze beperking te overwinnen, moet retinale organoïde technologie meer biologische en cellulaire kenmerken integreren, waaronder gladde spiercellen, vasculatuur en immuuncellen zoals microglia 12,13,14,15.

Organotypische retinale explantaten zijn naar voren gekomen als een betrouwbaar hulpmiddel voor het bestuderen van retinale ziekten zoals diabetische retinopathie en degeneratieve retinale ziekten 16,17,18,19. In vergelijking met andere bestaande technieken ondersteunt het gebruik van retinale explantaten zowel in vitro retinale celculturen als de huidige in vivo diermodellen door een uniek kenmerk toe te voegen om de cross-talk tussen verschillende retinale cellen onder dezelfde biochemische parameters en onafhankelijk van systemische variabelen te bestuderen. De explantculturen maken het mogelijk om verschillende retinale cellen bij elkaar te houden in dezelfde omgeving, waardoor het behoud van retinale intercellulaire interacties mogelijk is 20,21,22. Bovendien toonde een eerdere studie aan dat retinale explantaten in staat waren om de morfologische structuur en functionaliteit van de gekweekte retinale cellen te behouden²³. Retinale explantaten kunnen dus een fatsoenlijk platform bieden voor het onderzoeken van mogelijke therapeutische doelen voor een breed scala aan retinale ziekten 24,25,26. Retinale explantculturen bieden een controleerbare techniek en zijn een zeer flexibele vervanger voor bestaande motten die talrijke farmacologische manipulaties mogelijk maken en verschillende moleculaire mechanismen kunnen blootleggen²⁷.

Het algemene doel van dit artikel is om de retinale explanttechniek te presenteren als een redelijk tussenmodelsysteem tussen in vitro celculturen en in vivo diermodellen. Deze techniek kan retinale functies op een betere manier nabootsen dan gedissocieerde cellen. Aangezien verschillende retinale lagen intact blijven, kunnen de retinale intercellulaire interacties in het laboratorium worden beoordeeld onder goed gecontroleerde biochemische omstandigheden en onafhankelijk van het functioneren van het vasculaire systeem²⁸.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Oakland University, Rochester, MI, VS en volgden de richtlijnen die zijn opgesteld door de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. 1. Voorbereiding van dieren Houd de dieren gehuisvest onder een constante temperatuur in een licht gecontroleerde omgeving. De temperat…

Representative Results

Overleving van de neuronale en vasculaire retinale cellen van de retinale explant in kweekmedia ex vivo gedurende een langere tijdDoor een retinale explant te kweken met behulp van ons protocol, waren we succesvol in het onderhouden van verschillende retinale cellen die tot 2 weken levensvatbaar waren. Om de aanwezigheid van verschillende retinale cellen te verifiëren, werd immunofluorescentiekleuring van de retinale explant uitgevoerd met behulp van een ne…

Discussion

Ons lab bestudeert al jaren de pathofysiologische veranderingen die retinale microvasculaire disfunctie bevorderen 31,32,33,34,35,36. Retinale explantaten zijn een van de technieken die van grote waarde kunnen zijn om te gebruiken als model voor het bestuderen van retinale ziekten zoals diabetische retinopathie of degeneratie…

Materials

Adult C57Bl/6J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA	664
All-in-One Fluorescence Microscope	KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.	BZ-X800
B27 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17504-04
Blockade blocking solution	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	B10710
DMEM F12	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #11320033
Goat anti-Rabbit IgG.	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	F-2765
GSL I, BSL I (Isolectin)	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	B-1105-2
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #14175095
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades	World Precision Instruments,FL 34240, USA	Straight (503365)
N2 supplements	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	Gibco #17502-048
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	140652
Paraformaldehyde 4% in PBS	BBP, Ashland, MA, 01721 USA	C25N107
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	15140148
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).	Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA	P36962
Rabbit Anti-NeuN Antibody	Abcam.,Cambridge, UK	ab177487
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody	Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.	Z0334
Texas Red	Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA	SA-5006-1
TritonX	BioRad Hercules, CA,  94547,USA	1610407