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Neurosciences

自由に動くマウスにおける腸由来微生物代謝物の脳室内送達

Published: June 02, 2022
doi:
10.3791/63972
, ,
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine,National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine,National Cheng Kung University

Summary

腸由来の微生物代謝物は、動物の複雑な行動につながる多面的な影響を及ぼします。私たちは、ガイドカニューレを介した脳室内送達を介して脳内の腸由来微生物代謝物の影響を描写するための段階的な方法を提供することを目指しています。

Abstract

腸内細菌叢とその代謝産物が宿主の生理学と行動に与える影響は、この10年間で広範囲に調査されてきました。多くの研究により、腸内細菌叢由来の代謝物が宿主の複雑な腸脳経路を介して脳を介した生理学的機能を調節することが明らかになっています。短鎖脂肪酸(SCFA)は、腸内細菌叢による食物繊維発酵中に生成される主要な細菌由来の代謝物です。腸から分泌されたSCFAは、末梢の複数の部位で作用し、SCFA受容体の膨大な分布により、免疫、内分泌、および神経応答に影響を与える可能性があります。したがって、SCFAの経口および腹腔内投与を通じてSCFAの中枢および末梢効果を区別することは困難です。この論文は、自由に動くマウスのガイドカニューレ を介して 脳内のSCFAの機能的役割を調べるビデオベースの方法を提示します。脳内のSCFAの量と種類は、注入量と速度を制御することによって調整できます。この方法は、脳内の腸由来代謝物の役割を理解する方法を科学者に提供することができます。

Introduction

ヒトの胃腸管には、宿主に影響を与える多様な微生物が宿主を宿している1,2,3。これらの腸内細菌は、宿主によって消費される食事成分の利用中に腸由来の代謝産物を分泌することができる4,5。興味深いことに、末梢で代謝されていない腸代謝産物は、循環を介して他の臓器に輸送することができます6。注目すべきことに、これらの分泌された代謝産物は、中枢神経系と腸の間の双方向通信として定義される腸脳軸のメディエーターとして機能することができます7。以前の研究では、腸由来の代謝物が動物の複雑な行動や感情を調節できることが示されています8,9,10,11。

短鎖脂肪酸(SCFA)は、食物繊維と難消化性炭水化物の発酵中に腸内細菌叢によって生成される主要な代謝物です6。酢酸塩、プロピオン酸塩、および酪酸塩は、腸内で最も豊富なSCFAです12。SCFAは、消化管内の細胞のエネルギー源として機能します。腸内の代謝されていないSCFAは、門脈を通って脳に輸送され、脳と行動を調節することができます6,12。以前の研究では、SCFAが神経精神障害において重要な役割を果たす可能性があることが示唆されています6,12。例えば、自閉症スペクトラム障害(ASD)の動物モデルであるBTBR T+ Itpr3tf/J(BTBR)マウスへの酪酸の腹腔内注射は、彼らの社会的欠陥を救済しました13。うつ病の被験者から微生物叢を投与された抗生物質治療ラットは、不安様行動および糞便SCFAの増加を示した14。臨床的には、ASD患者では、通常発達中の対照と比較して、糞便SCFAレベルの変化が観察されました15,16。うつ病の人は、健康な被験者よりも糞便SCFAレベルが低くなっています17,18。これらの研究は、SCFAがさまざまな経路で動物や人間の行動を変える可能性があることを示唆しています。

微生物代謝産物は、体内の複数の部位に多様な影響を及ぼし、胃腸管、迷走神経、交感神経など、宿主の生理学と行動に影響を与えます4,19。末梢経路を介して代謝物を投与する場合、脳内の腸由来代謝物の正確な役割を特定することは困難です。.この論文では、自由に動くマウスの脳における腸由来代謝物の影響を調べるためのビデオベースのプロトコルを提示します(図1)。SCFAは行動テスト中にガイドカニューレを介して急性に投与できることを示しました。代謝物の種類、量、注入速度は、目的に応じて変更することができます。カニューレ挿入部位を調整して、特定の脳領域における腸代謝物の影響を調べることができます。私たちは、腸由来の微生物代謝物が脳と行動に与える潜在的な影響を探求する方法を科学者に提供することを目指しています。

Protocol

すべての実験プロトコルと動物の世話は、国立成功大学(NCKU)の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。 1. 実験動物の準備 ベンダーから6〜8週齢の野生型C57BL / 6JNarlオスマウスを入手します。 標準的なマウス飼料と滅菌水を 自由に入れた標準的なマウスケージにマウスを収容します。注意: NCKUの実験動物センタ?…

Representative Results

ガイドカニューレ移植からの回復から1週間後にマウスにSCFAを注入し、新規ケージ内の自発運動を評価した。マウスを新しいケージに入れ、最初の5分間で2,100 nLのSCFAまたはACSFを注入しました(送達速度7 nL / s)脳の側脳室に埋め込まれた市販のガイドカニューレを介して脳に注入します。新規ケージ内の自発運動は、注入後さらに30分間記録されました。.SCFAsとACSFの注入では、新規ケージ内の?…

Discussion

腸由来の代謝産物は、体内での複数の結合部位のために、あまり正確なメカニズムなしに脳介在性疾患と関連しています6,12,24。以前の報告では、SCFAがGタンパク質共役型受容体、エピジェネティック調節因子、および体内の複数の部位でのエネルギー生産の源のリガンドとして機能する可能性があることが示されました<su…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

国立成功大学(NCKU)の実験動物センターのスタッフに、動物の世話をしてくれたことに感謝します。この作業は、チェンシン医療財団のクンイェンファン教育基金からC.-W.L.への奨学金によってサポートされました。台湾の科学技術部(MOST)からの資金:(学部研究MOST 109-2813-C-006-095-B)からT.-H.Y.;(ほとんどの107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3)からW.-L.W.;高等教育スプラウトプロジェクト、教育省からNCKUの大学進学本部からW.-L.W.

Materials

Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383
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Citer Cet Article
Liou, C., Yao, T., Wu, W. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).
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