Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Summary

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Abstract

Een telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing muislijn werd ontwikkeld om het gedrag en lot van volwassen weefselstamcellen te onderzoeken, door het ‘Tet-On’-systeem oTet-Cre-muis te kruisen met een nieuw omgekeerd tetracycline transactivator (rtTA) transgen gekoppeld aan de Tert-promotor, waarvan we hebben aangetoond dat het een nieuwe populatie van volwassen hersenstamcellen markeert. Hier zal toediening van het tetracyclinederivaat doxycycline aan mTert-rtTA::oTet-Cre-muizen onuitwisbaar een populatie cellen markeren die een 4,4 kb-fragment van het promotorgebied van het gen Tert tot expressie brengen. In combinatie met de Rosa-mTmG-reporter zullen mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-muizen membraan tdTomato (mTomato) tot expressie brengen totdat doxycyclinebehandeling de vervanging van mTomato-expressie door membraan-EGFP (mGFP) induceert in cellen die ook Tert tot expressie brengen. Daarom, wanneer deze triple-transgene lineage tracing muizen doxycycline ontvangen (de “puls” periode waarin TERT-expressiecellen worden gemarkeerd), zullen deze cellen onuitwisbaar gemarkeerde mGFP + -cellen worden, die gedurende elke gewenste hoeveelheid tijd na doxycycline-verwijdering kunnen worden gevolgd (de “chase” -periode), zelfs als Tert-expressie vervolgens verloren gaat. Hersenen worden vervolgens perfusie-gefixeerd en verwerkt voor immunofluorescentie en andere downstream-toepassingen om veranderingen in stamcelactivering, proliferatie, afstammingsverbintenis, migratie naar verschillende hersenniches en differentiatie naar volwassen celtypen te interpreteren. Met behulp van dit systeem kan elke rtTA-muis worden gekoppeld aan oTet-Cre en een Rosa-verslaggever om doxycycline-induceerbare “pulse-chase” lineage tracing-experimenten uit te voeren met behulp van markers van stamcellen.

Introduction

Waarde van een afstammingsmuislijn
Analyse van stamcellen in vivo kan moeilijk zijn, omdat veel testen die dergelijke cellen onderzoeken zich alleen richten op het karakteriseren van deze cellen op het moment van overlijden van het dier, wat een terminale momentopname in de tijd vertegenwoordigt. Om de processen van proliferatie, differentiatie en migratie van voorlopercellen, intermediaire / overgangsceltypen en volwassen cellen in de loop van de tijd beter te begrijpen, is een longitudinale analysebenadering vereist. Dit kan worden bereikt met afstammingstraceringsstudies waarbij stam-/voorlopercellen onuitwisbaar worden gemarkeerd en daarna gedurende elke tijd kunnen worden gevolgd¹.

In het volwassen zoogdierbrein werd het proces van neurogenese waarbij volwassen neuronen worden gemaakt van stam- en voorlopercellen voor het eerst geanalyseerd via labelretentie met thymidine-H^{3 2,3,4} of 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU)^5,6,7,8 . In deze studies werden proliferatieve cellen gemarkeerd met het thymine-analoog, dat tijdens replicatie en celdeling / proliferatie in het DNA van de cellen werd opgenomen. De gemarkeerde cel, evenals hun nageslacht, bevatte daarom dit analoog, dat vervolgens post-mortem werd geïdentificeerd. Hoewel thymidine-H³ en BrdU het mogelijk maakten om proliferatieve cellen en hun nakomelingen te markeren in hersengebieden waar stamcellen slecht werden begrepen, werden deze studies belemmerd door de nadelen van deze hulpmiddelen. Thymidine-H³ induceert celcyclusstilstand, apoptose en dosisafhankelijke DNA-syntheseremming⁹, terwijl BrdU cellen op verschillende niveaus markeert, afhankelijk van de toedieningsweg¹⁰ en wordt opgenomen door cellen tijdens reparatie of apoptose, evenals tijdens celdeling¹¹. Efficiëntere etiketteringsmethoden zijn onlangs gebruikt, zoals etikettering met 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU), maar veel van dezelfde problemen als BrdU blijven nog steeds¹². Deze benaderingen zijn ook beperkend omdat ze elke proliferatieve cel markeren, niet alleen stamcellen, en dus kan de interpretatie van de resultaten worden verward. In de neurogene afstamming behouden alle stam- en voorlopercellen de mitotische capaciteit en alleen terminale / volwassen neuronen zijn niet proliferatief. Voor astrocyten en microglia, maar niet voor oligodendrocyten, wordt de proliferatie voor onbepaalde tijd gehandhaafd 13,14,15.

Transgene muizen die worden gebruikt om alleen cellen te traceren die een eiwit van belang uitdrukken, zoals een eiwit waarvan is bevestigd dat het volwassen stamcellen identificeert zoals we hier gebruiken, zijn daarom gebruikelijker geworden bij het onderzoeken van stamcellen en hun nakomelingen. Hoewel het moeilijk te genereren is via transgene benaderingen van muizen, maken afstammingstracerende muislijnen het mogelijk om specifiek gemarkeerde cellen in de hersenen te traceren en zijn ze niet alleen afhankelijk van proliferatie. In het Tet-On transgene muissysteem induceert toediening van tetracycline of doxycycline (een tetracyclinederivaat) Cre-recombinase-expressie in cellen die zijn ontworpen met een omgekeerde tetracyclinetransactivator (rtTA), die wordt getranscribeerd door een promotor van belang. De Tet-induceerbare Cre-gedreven recombinatie activeert dan de expressie van een onuitwisbaar fluorescerend of luminescerend eiwit in de cellen van belang, afhankelijk van de gebruikte Rosa-reporter muis. Deze onuitwisbaar gemarkeerde cellen blijven deze verslaggever tot expressie brengen na deling, differentiatie of migratie, waardoor deze cellen en hun nakomelingen in de loop van de tijd of na verschillende interventies kunnen worden gevolgd¹⁶. Voordelen van transgene benaderingen voor het traceren van afstamming zijn onder meer: 1) specificiteit van tracering naar een bepaalde cellijn of voorloper/stamcel gemarkeerd door de rtTA, 2) onuitwisbare expressie van het fluorescerende of luminescerende eiwit ondanks celvernieuwing of differentiatie, 3) lage toxiciteit, 4) voorwaardelijke activering tijdens elk punt in de levenscyclus van het dier, en 5) gebruiksgemak met gemeenschappelijke testen, inclusief immunostaining/immunofluorescentie¹⁶.

Andere methoden van tijdelijk induceerbare reportertools bij muizen zijn het gebruik van Cre-ERT2-muizen, die kunnen worden gecombineerd met ROSA-GFP, ROSA-mTmG of andere fluorescerende reportertransgenen. Bij deze dieren drijft een celspecifiek regulerend element, zoals een promotor of enhancer-gebied van belang, de productie van Cre-recombinase aan, dat alleen kan worden geactiveerd via de toediening van tamoxifen. Hoewel Cre-ERT2-muislijnen de inductie van Cre in specifieke cellijnen mogelijk maken, is er een schat aan kennis over de effecten van tamoxifen op volwassen neurogenese^17,18. Bovendien bestaan er veel ROSA-aangedreven fluorescerende reportergenen die kunnen worden gebruikt in plaats van GFP of mTmG, waaronder YFP of CFP, wat alternatieve fluorescerende labeling in andere fluorescerende golflengten mogelijk zou maken. Deze fluorescerende reportergenen kunnen worden gebruikt met Tet-On- of Cre-ERT2-systemen.

Telomerase reverse transcriptase (TERT) is de snelheidsbeperkende component van het holo-enzym telomerase, dat werkt om telomeren uit te breiden nadat ze zijn verkort tijdens celdeling^19,20. TERT is geïdentificeerd als een marker van volwassen weefselstamcellen in de darm^21,22, beenmerg²¹, lever²³,^{vetweefsel 24}, endometrium^25,26 en bot¹. Of TERT-expressie in deze volwassen stamcellen uitsluitend voor telomerase-uitbreidende activiteit is of voor het uitvoeren van niet-canonieke TERT-rollen²⁷ is nog onbekend. TERT-expresserende rustige volwassen stamcellen (qASCs) zijn geïdentificeerd en getraceerd door het hele lichaam met transgene afstamming tracerende muizen om de multipotentie en het zelfvernieuwingsvermogen van deze stamcellen te bestuderen, evenals hun potentieel om te activeren, te vermenigvuldigen, te differentiëren en te migreren 1,22,23,28. De creatie van het Tert-rtTA transgen is eerder uitgevoerd¹. In dit artikel zullen we het gebruik beschrijven van een afstamming die TERT-muislijn traceert om TERT + qASCs te bestuderen die we hebben geïdentificeerd als een nieuwe ASC-populatie in het volwassen muizenbrein.

Generatie van een transgene afstammingslijntraceringsmuislijn
Om een afstammingsspoormuislijn te genereren met behulp van het Tet-On-systeem, moeten drie transgenen worden gecombineerd binnen één dier door middel van muisparing. De eerste is een rtTA, uitgedrukt onder de controle van de promotor van het gen van belang (de onze is TERT-rtTA). In een cel die dit gen van belang tot expressie brengt, zal de rtTA dus tot expressie komen. Het tweede is een oTet-Cre-gen, dat een tetracycline-responselement (TRE) bevat dat de transcriptie van Cre-recombinase mogelijk maakt in aanwezigheid van zowel een rtTA-fusietranscript als tetracycline of doxycycline. Tetracycline of doxycycline kan aan een dier worden toegediend via drinkwater of chow²⁹. Ten slotte moet er een gen zijn dat wordt geactiveerd door Cre-recombinasesplitsing. In dit manuscript is het etiketteringsgen dat we zullen beschrijven het Rosa26-mTmG-gen, dat tot Cre-recombinatie alomtegenwoordig mTomato (membraanrode fluorescentie in alle cellen) zal transcriberen. Als een cel echter het rtTA-transcript tot expressie brengt en tetracycline of doxycycline bevat, zal Cre-recombinatie van een set lox P-sites tussen de mTomato- en mGFP-sites de R26-site veranderen en ervoor zorgen dat de cel membraan-EGFP (mGFP of membraangroene fluorescentie) produceert in plaats van membraantomaat. De onuitwisbare aard van dit mGFP-signaal zal het mogelijk maken om cellen in vivo te labelen en te traceren terwijl ze zich vermenigvuldigen, migreren en differentiëren. Na het spoor kunnen cellen worden geanalyseerd op expressie van GFP via immunofluorescentie in standaard cryosecties of dikkere optisch geklaarde hersenen.

In dit artikel beschrijven we het gebruik van de specifieke muislijn, mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Om deze drievoudige transgene muislijn te creëren, hebben we eerst oTet-Cre-dieren (The Jackson Lab-stam #006234) gekoppeld aan Rosa-mTmG-dieren (The Jackson Lab-stam #007676) om oTet-Cre::Rosa-mTmG dubbele transgene muizen te creëren. Deze dieren werden gegenotypeerd met primers en PCR-sjablonen die zijn aangegeven in de aanvullende tabellen 1 en 2. mTert-rtTA muizen (gemaakt door David Breault¹) werden gepaard met oTet-Cre::Rosa-mTmG dieren om mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG muizen te creëren (Figuur 1A)^1,30. Het werkingsmechanisme van de muislijn mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG wordt geïllustreerd in figuur 1B.

Doxycycline inductie en pulse-chase ontwerp
Bij het plannen van experimenten is het belangrijk om rekening te houden met verschillende factoren die van invloed zijn op de uitkomst van experimenten met het traceren van afstamming, waaronder de leeftijd van het dier bij doxycycline-inductie, de lengte van de toediening van doxycycline (de “puls” -periode), de tijdsduur na verwijdering van doxycycline vóór weefselverzameling (de “chase” -periode) en de timing van eventuele interventies tijdens deze processen. Deze overwegingen voor de onderzoeksopzet zijn essentieel voor het begrijpen van de gelabelde cellen en hun nakomelingen aan het einde van het experiment. De eerste stap in het proces is het identificeren van de leeftijd van interesse van het dier en de lengte van de toediening van doxycycline. Langere pulsperioden zullen het mogelijk maken dat meer cellen de rtTA-gekoppelde promotor tot expressie brengen en dat meer cellen van belang onuitwisbaar worden gemarkeerd. Een celtype dat voorbijgaande expressie van het gen van belang vertoont, kan een langere pulsperiode vereisen dan cellen die continu het gen van belang tot expressie brengen. Als het doel van de studie echter is om kortetermijneffecten van de cel van belang of een acute interventie te begrijpen, kan de pulsperiode niet te lang zijn, omdat zodra een cel is gemarkeerd, deze gedurende de rest van de pulsperiode door een willekeurig aantal veranderingen zal worden getraceerd. In sommige van onze studies werd een 2-daagse puls zonder achtervolgingsperiode gebruikt om een directe verslaggever voor TERT beter na te bootsen. Dit komt omdat de minimale tijdsduur voor recombinatie van het Rosa-mTmG-gen 2 dagen³¹ is.

De volgende essentiële periode in een pulsachtervolgingsexperiment is de lengte tussen verwijdering van doxycycline en perfusie van het dier, ook bekend als de ‘achtervolging’. De halfwaardetijd van doxycycline bij muizen is ongeveer 170 minuten, ongeacht de toedieningsweg, waardoor de conclusie mogelijk is dat doxycycline-inductie waarschijnlijk enkele uren na verwijdering niet meer optreedt³². Het is echter belangrijk op te merken dat het doxycyclinemetabolisme langzamer is bij oudere muizen, wat kan leiden tot langere effectieve ‘pols’-perioden dan jonge dieren³³.

Tijdens de achtervolgingsperiode zullen gelabelde cellen blijven worden gelabeld, zelfs na proliferatie, differentiatie of migratie. Het nageslacht van deze cellen zal ook worden gelabeld. Het doel van de studie zal de lengte van het pulse-chase paradigma bepalen. Als het doel van de studie is om de regeneratie van een weefsel over een lange periode met de cellen van belang te begrijpen, kan een lange achtervolgingsperiode nodig zijn. Ten slotte moet de timing van eventuele interventies of behandelingen worden bepaald. Toediening tijdens de pulsperiode zal van invloed zijn op de cellen die het gen van belang tot expressie brengen, evenals op elk nageslacht dat in deze periode is gecreëerd, terwijl toediening tijdens de achtervolgingsperiode meestal het nageslacht van de cellen van belang kan beïnvloeden, hoewel dit zal afhangen van hoe snel de gelabelde cellen delen of differentiëren. Voorbeelden van experimentele ontwerpen die we hebben gebruikt, zijn te zien in figuur 2A.

Het is ook belangrijk om op de hoogte te zijn van de mogelijkheid van een GFP-signaal op de achtergrond als gevolg van lekkende expressie. Lekkende expressie treedt op als gevolg van inherente bindingspotentiaal tussen rtTA- en otetsequenties in afwezigheid van doxycycline, en restactiviteit van het otettransgen bij afwezigheid van rtta (herzien in³⁴). Lekkende expressie vertegenwoordigt een zwakte van de Tet-systemen, en hoewel het lek vaak een acceptabel nadeel van het systeem is, kunnen situaties waarin de lekkende expressie kan leiden tot toxiciteit en mortaliteit, zoals bij diptheria-toxine (DTA) bij Otet-DTA-dieren, het gebruik van deze systemen beperken³⁵.

Hersenverwerking, sectie en immunofluorescentie van dunne secties voor microscopie
Om de hersenen van muizen te analyseren na een afstammingstraceringsexperiment, moeten muizen eerst worden doordrenkt via transcardiale perfusie om bloed en liquor te verwijderen die kunnen leiden tot hoge autofluorescentie in de hersenen. Er zijn twee veelgebruikte fixatieven waarmee het dier kan worden doordrenkt: Histochoice Tissue Fixative, een glyoxal fixatief (GF) of 4% paraformaldehyde (PFA). Glyoxal-fixatieven zorgen voor een relatief zacht fixatieproces met minder cross-linking dan PFA. Dit vermindert weefselstijfheid, vermindert de behoefte aan het ophalen van antigeen en zorgt voor minder geconcentreerde antilichaamoplossingen tijdens immunostaining. Als ze echter methanol bevatten, kan dit dienen om de autofluorescentie te verhogen³⁶. Aan de andere kant zal PFA vaak een robuustere fixatie mogelijk maken, en hoewel antigeen ophalen vereist zal zijn tijdens immunostaining, zijn er antilichamen die alleen werken met PFA-gefixeerde weefsels, en perfusie met 4% PFA is vereist voor de optische clearingtechniek die later wordt beschreven.

Het volgen van perfusie is een post-fixatiestap, waarbij de hersenen worden ondergedompeld in hetzelfde type fixatief dat tijdens de perfusie ‘s nachts wordt gebruikt. Hierdoor kunnen alle hersengebieden die mogelijk niet volledig zijn gefixeerd tijdens de perfusie, blijven fixeren. Vervolgens worden hersenen geïncubeerd in sucrose in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om zoveel mogelijk water te verwijderen vóór de vriesstap om ijsvorming in het weefsel te voorkomen (“cryo-conservering”). Hersenen kunnen dan worden gesneden in een willekeurig aantal sagittale, coronale of transversale weefselsecties voor verwerking. Voor zowel precisie als reproduceerbaarheid moeten gekalibreerde hersenblokken worden gebruikt op een manier die zorgt voor consistente bregma-snijwonden tussen dieren. De belangrijkste factor die van invloed kan zijn op hoe hersenen worden gesegmenteerd, is het hersengebied (en) van belang. Bijvoorbeeld, terwijl een sagittale snede het mogelijk kan maken om meer hersengebieden in één weefselsectie te analyseren, zal deze snede geen analyse van neuro / gliogene gebieden van de ventriculaire-subventriculaire zone (V-SVZ) mogelijk maken, omdat de laterale en mediale zijden van de laterale ventrikel onmogelijk te onderscheiden zijn in die dimensie en beter worden waargenomen in het coronale vlak. Dit kan een belangrijk onderscheid zijn om te maken in neurogenesestudies bij volwassenen, omdat de laterale kant van de laterale ventrikel de neurogene V-SVZ bevat, terwijl de mediale wand van de laterale ventrikel een meer gliogene niche is³⁷.

Nadat weefsels zijn verdeeld in coronale, sagittale of dwarse secties, worden ze in blokken bevroren met behulp van optimal cooling temperature (OCT) inbeddingsoplossing. Hier worden de hersenen ingevroren in dit inbeddingsmateriaal, met behulp van een mengsel van droogijs en ethanol. Als dunne sectieanalyse vereist is, worden blokken op een cryostaat gesneden en afhankelijk van de vereiste downstream-analyse kunnen ze als dunne secties (<20 μm) worden gehecht aan positief geladen glasglaasjes. Glazen dia's die niet zijn opgeladen, kunnen ook worden gebruikt, maar het gebruik van niet-geladen dia's kan ertoe leiden dat weefsels losraken van de dia's³⁸. Als vrij zwevende weefselsecties van gemiddelde dikte (>20 μm) nodig zijn, worden weefsels verzameld als vrij zwevende secties. Als dikke secties (0,5-4 mm) nodig zijn, is het snijden van niet-bevroren hersensecties met een vibratoom vereist. Het is belangrijk om de opslagverschillen op te merken tussen secties op dia’s, die moeten worden ingevroren bij -20 tot -80 ° C en vrij zwevende secties, die bij 4 ° C worden opgeslagen.

Hersenzuivering en immunofluorescente confocale microscopie
Als een bredere, maar minder gedetailleerde analyse van de afstammingsgetraceerde cellen in het muizenbrein gewenst is, is een uitgebreide analyse van dikkere segmenten van hersenweefsel mogelijk met iDISCO-hersenreiniging³⁹ gevolgd door immunostaining en betegelde z-stack confocale microscopie of light-sheet microscopie. Hier zullen grote delen van de muizenhersenen optisch worden gewist (een proces van delipidatie³⁹), wat beter fluorescerende signaalbeeldvorming mogelijk maakt over een weefselsectie van 1 mm. De nadelen van dit proces zijn hoge autofluorescentie en een verminderd vermogen om hoge resolutie beelden van celmorfologie en gedetailleerde co-kleuringsanalyse te verkrijgen vanwege de grotere werkafstanden die nodig zijn in vergelijking met meer traditionele methoden (dunne cryosecties of vrij zwevende secties). Om deze reden raden we aan om hersenzuivering te analyseren om de grootschalige afstammingstraceringsresultaten in meerdere hersengebieden te analyseren, in plaats van te proberen individuele cellen te karakteriseren of te analyseren.

Protocol

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Ohio State University. 1. Creatie van een afstamming die tet-on muislijn, fokstrategieën en genotypering voor experimentele cohortmuizen traceert OPMERKING: Hier schetsen we de creatie van een Tet-On muissysteem met Rosa-mTmG als het fluorescerende reportergen dat Cre-recombinatie ondergaat, maar verschillende andere Cre-recombinatiegestu…

Representative Results

Hoewel het fluorescerende signaal dat het gevolg is van een Tet-On-systeem met een fluorescerende reporter zal variëren afhankelijk van de promotor van interesse en de gebruikte fluorofoor (en), zullen we beschrijven hoe bevindingen werden geanalyseerd met mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-dieren. Analyse van volwassen hersenen na een pulsachtervolging resulteerde in membraan GFP-expresserende cellen in verschillende anatomische niches. Het verschil in fluorescerende intensiteit tussen verschillende celtypen moet worden o…

Discussion

Een methode voor het creëren, gebruiken en analyseren van een triple transgene afstamming traceert muizenlijn die stamcellen markeert in het volwassen muizenbrein in vivo wordt beschreven. In combinatie met immunostaining of hersenreiniging kan de identificatie en karakterisering van getraceerde fluorescerende cellen in de hersenen worden bereikt. Deze techniek biedt de mogelijkheid om het plastische / regeneratieve / remodelleringspotentieel van gelabelde stamcellen te begrijpen terwijl ze activeren, migreren,…

Materials

Antibody diluent	Agilent	S080983-2
Antigen Retrieval Solution	Agilent	S2367
anti-GFP antibody	Invitrogen	A2311	Use at 1:500-1:000
Acetone	Fisher Scientific	A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J	The Jackson Laboratory	JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX:007676
Blocking Solution (IHC)	Millipore Sigma	20773
Blunt needle	BSTEAN	X0012SYHIV
Coronal brain block	Braintree	BS-2000C
Cover slip	Corning	2850-22
Cryostat	Leica	CM1900
DAPI	Sigma-Aldrich	D564
Dibenzyl ether	Millipore Sigma	33630
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
Doxycycline Hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
Glycine	Bio-Rad	161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative	Amresco	H120	This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution	Sigma-Aldrich	516813
IHC Select TBS Rinse Buffer	Millipore Sigma	20845
Ketamine	Westward	0143-95095-10	This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Milipore Block	Millipore	20773
Mounting medium	Millipore Sigma	5013
Optimal Cutting Temperature Solution	Sakura	4583
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS Solution (10X)	Teknova	P0496
Sagittal brain block	Braintree	RBM-2000S
Saline	Braun	S8004-5264
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Sudan (Typogen) Black	Millipore Sigma	199664
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	186562
Tissue cartridge	Simport	M512
Triton X-100	Bio-Rad	1610407
Tween-20	Millipore Sigma	655205
Xylazine	AnaSed	sc-362950Rx