Abstammungsverfolgung von induzierbaren fluoreszenzmarkierten Stammzellen im erwachsenen Mäusegehirn

Summary

Die Fähigkeit, Stammzellen und ihre Nachkommen mit einem Fluorophor unter Verwendung einer induzierbaren transgenen Linienverfolgungs-Mauslinie dauerhaft zu markieren, ermöglicht eine räumliche und zeitliche Analyse von Aktivierung, Proliferation, Migration und / oder Differenzierung in vivo. Die Abstammungsverfolgung kann neue Informationen über die Verpflichtung der Abstammung, die Reaktion auf Interventionen und die Multipotenz aufdecken.

Abstract

Eine Telomerase-Reverse-Transkriptase (Tert) -Linie zur Verfolgung der Maus wurde entwickelt, um das Verhalten und Schicksal von adulten Gewebestammzellen zu untersuchen, indem das “Tet-On” -System der Tet-Cre-Maus mit einem neuartigen Reverse-Tetracyclin-Transaktivator-Transgen (rtTA) gekreuzt wurde, das mit dem Tert-Promotor verbunden ist, von dem wir gezeigt haben, dass es eine neuartige Population von adulten Hirnstammzellen markiert. Hier markiert die Verabreichung des Tetracyclinderivats Doxycyclin an mTert-rtTA::oTet-Cre-Mäuse unauslöschlich eine Population von Zellen, die ein 4,4 kb Fragment der Promotorregion des Gens Tert exprimieren. In Kombination mit dem Rosa-mTmG-Reporter exprimieren mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mäuse die Membran tdTomato (mTomato), bis die Doxycyclin-Behandlung den Ersatz der mTomato-Expression durch Membran-EGFP (mGFP) in Zellen induziert, die auch Tert exprimieren. Wenn diese dreifach transgenen Linienverfolgungsmäuse Doxycyclin erhalten (die “Pulsperiode”, in der TERT-exprimierende Zellen markiert werden), werden diese Zellen zu unauslöschlich markierten mGFP + -Zellen, die nach der Doxycyclinentfernung (der “Chase” -Periode) für jede wünschenswerte Zeit verfolgt werden können, selbst wenn die Tert-Expression anschließend verloren geht. Gehirne werden dann perfusionsfixiert und für Immunfluoreszenz und andere nachgelagerte Anwendungen verarbeitet, um Veränderungen der Stammzellaktivierung, Proliferation, Abstammungsbindung, Migration zu verschiedenen Gehirnnischen und Differenzierung zu reifen Zelltypen zu interpretieren. Mit diesem System kann jede rtTA-Maus mit oTet-Cre und einem Rosa-Reporter verbunden werden, um Doxycyclin-induzierbare “Pulse-Chase” -Lineage-Tracing-Experimente mit Markern von Stammzellen durchzuführen.

Introduction

Wert einer Linie mit der Ablaufverfolgung der Mauslinie
Die Analyse von Stammzellen in vivo kann schwierig sein, da sich viele Assays, die solche Zellen untersuchen, nur auf die Charakterisierung dieser Zellen zum Zeitpunkt des Todes des Tieres konzentrieren, was eine terminale Momentaufnahme in der Zeit darstellt. Um die Prozesse der Proliferation, Differenzierung und Migration von Vorläufer-, Zwischen- / Übergangszelltypen und reifen Zellen im Laufe der Zeit besser zu verstehen, ist ein Längsschnittanalyseansatz erforderlich. Dies kann mit Lineage-Tracing-Studien erreicht werden, bei denen Stamm-/Vorläuferzellen unauslöschlich markiert werden und danach beliebig lange verfolgt werden^{können 1}.

Im erwachsenen Säugetiergehirn wurde der Prozess der Neurogenese, bei dem erwachsene Neuronen aus Stamm- und Vorläuferzellen gebildet werden, zunächst mittels Markierungsretention mit Thymidin-H3 ^2,3,4 oder 5-Brom-2′-desoxyuridin (BrdU) 5,6,7,8 analysiert. . In diesen Studien wurden proliferative Zellen mit dem Thyminanalogon markiert, das während der Replikation und Zellteilung / -proliferation in die DNA der Zellen eingebaut wurde. Die markierte Zelle sowie ihre Nachkommen enthielten daher dieses Analogon, das dann post mortem identifiziert wurde. Während^Thymidin-H3 und BrdU jedoch die Markierung von proliferativen Zellen und ihren Nachkommen in Gehirnregionen ermöglichten, in denen Stammzellen kaum verstanden wurden, wurden diese Studien durch die Nachteile dieser Werkzeuge behindert. Thymidin-H³ induziert Zellzyklus-Stillstand, Apoptose und dosisabhängige DNA-Synthesehemmung⁹, während BrdU Zellen in Abhängigkeit vom Verabreichungsweg¹⁰ auf unterschiedlichen Ebenen markiert und von Zellen während der Reparatur oder Apoptose sowie während der Zellteilung^{11 aufgenommen wird}. In letzter Zeit wurden effizientere Markierungsmethoden verwendet, wie z.B. die Markierung mit 5-Ethynyl-2′-desoxyuridin (EdU), aber viele der gleichen Probleme wie BrdU bleiben^{immer noch 12}. Diese Ansätze sind auch insofern einschränkend, als sie jede proliferative Zelle markieren, nicht nur Stammzellen, und somit die Interpretation der Ergebnisse durcheinander gebracht werden kann. In der neurogenen Linie behalten alle Stamm- und Vorläuferzellen die mitotische Kapazität, und nur terminale / reife Neuronen sind nicht proliferativ. Für Astrozyten und Mikroglia, aber nicht für Oligodendrozyten, wird die Proliferation auf unbestimmte Zeit^{aufrechterhalten 13,14,15}.

Transgene Mäuse, die verwendet werden, um nur Zellen zu verfolgen, die ein Protein von Interesse ausdrücken, wie z.B. eines, das bestätigt wurde, adulte Stammzellen zu identifizieren, wie wir es hier verwenden, sind daher bei der Untersuchung von Stammzellen und ihren Nachkommen häufiger geworden. Obwohl es schwierig ist, sie durch transgene Ansätze der Maus zu erzeugen, ermöglichen Abstammungsverfolgungs-Mauslinien die Verfolgung von spezifisch markierten Zellen im Gehirn und verlassen sich nicht nur auf die Proliferation. Im transgenen Tet-On-Maussystem induziert die Verabreichung von Tetracyclin oder Doxycyclin (ein Tetracyclinderivat) die Cre-Rekombinase-Expression in Zellen, die mit einem Reverse-Tetracyclin-Transaktivator (rtTA) hergestellt wurden, der von einem Promotor von Interesse transkribiert wird. Die Tet-induzierbare Cre-gesteuerte Rekombination aktiviert dann die Expression eines unauslöschlichen fluoreszierenden oder lumineszierenden Proteins in den interessierenden Zellen, abhängig von der verwendeten Rosa-Reporter-Maus. Diese unauslöschlich markierten Zellen exprimieren diesen Reporter weiterhin nach der Teilung, Differenzierung oder Migration, was die Verfolgung dieser Zellen und ihrer Nachkommen im Laufe der Zeit oder nach verschiedenen Interventionen^{ermöglicht 16}. Zu den Vorteilen transgener Lineage-Tracing-Ansätze gehören: 1) Spezifität der Rückverfolgung zu einer bestimmten Zelllinie oder Vorläufer-/Stammzelle, die durch die rtTA markiert ist, 2) unauslöschliche Expression des fluoreszierenden oder lumineszierenden Proteins trotz Zellumsatz oder Differenzierung, 3) geringe Toxizität, 4) bedingte Aktivierung zu jedem Zeitpunkt im Lebenszyklus des Tieres und 5) Benutzerfreundlichkeit mit gängigen Assays, einschließlich Immunfärbung/Immunfluoreszenz¹⁶.

Andere Methoden von zeitlich induzierbaren Reporterwerkzeugen bei Mäusen umfassen die Verwendung von Cre-ERT2-Mäusen, die mit ROSA-GFP, ROSA-mTmG oder anderen fluoreszierenden Reportertransgenen gepaart werden können. Bei diesen Tieren treibt ein zellspezifisches regulatorisches Element, wie z.B. eine interessierende Promotor- oder Enhancerregion, die Produktion der Cre-Rekombinase an, die nur über die Gabe von Tamoxifen aktiviert werden kann. Während Cre-ERT2-Mauslinien die Induktion von Cre in bestimmten Zelllinien ermöglichen, gibt es eine Fülle von Kenntnissen über die Auswirkungen von Tamoxifen auf die adulte Neurogenese^17,18. Darüber hinaus gibt es viele ROSA-gesteuerte fluoreszierende Reportergene, die anstelle von GFP oder mTmG verwendet werden können, einschließlich YFP oder CFP, was eine alternative Fluoreszenzmarkierung in anderen fluoreszierenden Wellenlängen ermöglichen würde. Diese fluoreszierenden Reportergene können mit Tet-On- oder Cre-ERT2-Systemen verwendet werden.

Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT) ist die geschwindigkeitsbegrenzende Komponente des Holoenzyms Telomerase, das die Telomere verlängert, nachdem sie während der Zellteilung^{verkürzt wurden 19,20}. TERT wurde als Marker für adulte Gewebestammzellen im Darm 21,22, im Knochenmark 21, in der Leber 23, im Fett 24, im Endometrium ^25,26 und im Knochen 1 identifiziert. Ob die TER-Expression in diesen adulten Stammzellen ausschließlich der Telomerase-verlängernden Aktivität oder der Durchführung nicht-kanonischer TER-Rollen²⁷ dient, ist noch nicht bekannt. TERT-exprimierende ruhende adulte Stammzellen (qASCs) wurden identifiziert und im ganzen Körper mit transgenen Linien-Tracing-Mäusen verfolgt, um die Multipotenz und Selbsterneuerungsfähigkeit dieser Stammzellen sowie ihr Potenzial zur Aktivierung, Vermehrung, Differenzierung und Migration von 1,22,23,28 zu untersuchen. Die Erzeugung des Tert-rtTA-Transgens wurde zuvor^{durchgeführt 1}. In diesem Artikel werden wir die Verwendung einer PERT-Mauslinie beschreiben, die eine Linie verfolgt, um TERT + qASCs zu untersuchen, die wir als neuartige ASC-Population im erwachsenen Mäusegehirn identifiziert haben.

Generierung einer transgenen Linie Tracing Mauslinie
Um mit dem Tet-On-System eine Linie der Maus zu erzeugen, müssen drei Transgene durch Mauspaarung in einem einzigen Tier kombiniert werden. Die erste ist eine rtTA, die unter der Kontrolle des Promotors des interessierenden Gens (unseres ist TERT-rtTA) exprimiert wird. In einer Zelle, die dieses Gen von Interesse exprimiert, wird daher die rtTA exprimiert. Das zweite ist ein oTet-Cre-Gen, das ein Tetracyclin-Antwortelement (TRE) enthält, das die Transkription der Cre-Rekombinase in Gegenwart eines rtTA-Fusionstranskripts und Tetracyclin oder Doxycyclin ermöglicht. Tetracyclin oder Doxycyclin kann einem Tier über Trinkwasser oder Chow²⁹ verabreicht werden. Schließlich muss es ein Gen geben, das durch die Cre-Rekombinase-Spaltung aktiviert wird. In diesem Manuskript ist das Markierungsgen, das wir beschreiben werden, das Rosa26-mTmG-Gen, das bis zur Cre-Rekombination die mTomate (rote Membranfluoreszenz in allen Zellen) ubiquitär transkribiert. Wenn jedoch eine Zelle das rtTA-Transkript exprimiert und Tetracyclin oder Doxycyclin enthält, verändert die Cre-Rekombination einer Reihe von lox-P-Stellen zwischen den mTomato- und mGFP-Stellen die R26-Stelle und bewirkt, dass die Zelle Membran-EGFP (mGFP oder Membrangrünfluoreszenz) anstelle von Membrantomaten produziert. Die unauslöschliche Natur dieses mGFP-Signals wird eine In-vivo-Markierung und Rückverfolgung von Zellen ermöglichen, während sie sich vermehren, migrieren und differenzieren. Nach der Spur können Zellen auf die Expression von GFP über Immunfluoreszenz in Standard-Kryosektionen oder dickeren optisch gereinigten Gehirnen analysiert werden.

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung der spezifischen Mauslinie mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Um diese dreifache transgene Mauslinie zu erstellen, haben wir zuerst oTet-Cre-Tiere (The Jackson Lab Stamm #006234) mit Rosa-mTmG-Tieren (The Jackson Lab Stamm #007676) gepaart, um oTet-Cre::Rosa-mTmG doppelte transgene Mäuse zu erzeugen. Diese Tiere wurden mit Primern und PCR-Schablonen genotypisiert, die in den ergänzenden Tabellen 1 und 2 angegeben sind. mTert-rtTA-Mäuse (erstellt von David Breault 1) wurden mit oTet-Cre::Rosa-mTmG-Tieren verpaart, um mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mäuse zu erzeugen (Abbildung 1A)^1,30. Der Wirkmechanismus der mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Mauslinie ist in Abbildung 1B dargestellt.

Doxycyclin-Induktions- und Puls-Chase-Design
Bei der Planung von Experimenten ist es wichtig, mehrere Faktoren zu berücksichtigen, die das Ergebnis von Linienverfolgungsexperimenten beeinflussen, einschließlich des Alters des Tieres bei der Doxycyclinduktion, der Länge der Doxycyclin-Verabreichung (der “Puls” -Periode), der Zeitspanne nach der Doxycyclinentfernung vor der Gewebeentnahme (die “Chase” -Periode) und dem Zeitpunkt von Eingriffen während dieser Prozesse. Diese Überlegungen zum Studiendesign sind für das Verständnis der markierten Zellen und ihrer Nachkommen am Ende des Experiments unerlässlich. Der erste Schritt in diesem Prozess besteht darin, das Alter des Interesses des Tieres und die Dauer der Doxycyclin-Verabreichung zu identifizieren. Längere Pulsperioden werden es ermöglichen, dass mehr Zellen den rtTA-verknüpften Promotor exprimieren und mehr Zellen von Interesse unauslöschlich markiert werden. Ein Zelltyp, der eine vorübergehende Expression des interessierenden Gens aufweist, kann eine längere Pulsperiode erfordern als Zellen, die das interessierende Gen kontinuierlich exprimieren. Wenn das Ziel der Studie jedoch darin besteht, kurzfristige Auswirkungen der interessierenden Zelle oder einer akuten Intervention zu verstehen, kann die Pulsperiode nicht zu lang sein, da eine Zelle, sobald sie markiert ist, durch eine beliebige Anzahl von Veränderungen während des Rests der Pulsperiode verfolgt wird. In einigen unserer Studien wurde ein 2-tägiger Puls ohne Verfolgungszeit verwendet, um einen Direktreporter für TERT genauer nachzuahmen. Dies liegt daran, dass die Mindestdauer für die Rekombination des Rosa-mTmG-Gens 2 Tage³¹ beträgt.

Die nächste wesentliche Periode in einem Puls-Chase-Experiment ist die Länge zwischen der Entfernung von Doxycyclin und der Perfusion des Tieres, auch bekannt als “Chase”. Die Halbwertszeit von Doxycyclin in Mäusen beträgt unabhängig vom Verabreichungsweg etwa 170 Minuten, was den Schluss zulässt, dass die Doxycyclinduktion wahrscheinlich mehrere Stunden nach der Entfernung nicht mehr auftritt³². Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass der Doxycyclinstoffwechsel bei gealterten Mäusen langsamer ist, was zu längeren effektiven “Pulsperioden” führen kann als bei Jungtieren³³.

Während der Verfolgungszeit werden markierte Zellen weiterhin markiert, auch nach Proliferation, Differenzierung oder Migration. Die Nachkommen dieser Zellen werden ebenfalls markiert. Das Ziel der Studie wird die Länge des Puls-Chase-Paradigmas prägen. Wenn das Ziel der Studie darin besteht, die Regeneration eines Gewebes über einen langen Zeitraum mit den interessierenden Zellen zu verstehen, kann eine lange Verfolgungszeit erforderlich sein. Schließlich muss der Zeitpunkt etwaiger Eingriffe oder Behandlungen festgelegt werden. Die Verabreichung während der Pulsperiode wirkt sich auf die Zellen aus, die das Gen von Interesse ausdrücken, sowie auf alle Nachkommen, die während dieser Zeit erzeugt werden, während die Verabreichung während der Chase-Periode hauptsächlich Nachkommen der interessierenden Zellen betreffen kann, obwohl dies davon abhängt, wie schnell sich die markierten Zellen teilen oder differenzieren. Beispiele für experimentelle Pulse-Chase-Designs, die wir verwendet haben, sind in Abbildung 2A dargestellt.

Es ist auch wichtig, sich der Möglichkeit eines Hintergrund-GFP-Signals aufgrund eines undichten Ausdrucks bewusst zu sein. Die undichte Expression tritt als Folge des inhärenten Bindungspotentials zwischen rtTA und den Otet-Sequenzen in Abwesenheit von Doxycyclin und der Restaktivität des Otet-Transgens in Abwesenheit von rtTA auf (überprüft in³⁴). Die undichte Expression stellt eine Schwäche der Tet-Systeme dar, und obwohl das Leck oft ein akzeptabler Nachteil für das System ist, können Situationen, in denen die undichte Expression zu Toxizität und Mortalität führen kann, wie z. B. bei Diphtherietoxin (DTA) bei Otet-DTA-Tieren, die Verwendung dieser Systeme^{einschränken 35}.

Gehirnverarbeitung, Schnitt und Immunfluoreszenz von Dünnschnitten für die Mikroskopie
Um die Gehirne von Mäusen nach einem Linienverfolgungsexperiment zu analysieren, müssen Mäuse zuerst durch transkardiale Perfusion durchblutet werden, um Blut und Liquor zu entfernen, die zu einer hohen Autofluoreszenz im Gehirn führen können. Es gibt zwei häufig verwendete Fixiermittel, mit denen das Tier durchblutet werden kann: Histochoice Tissue Fixative, ein Glyoxalfixiermittel (GF), oder 4% Paraformaldehyd (PFA). Glyoxale Fixiermittel ermöglichen einen relativ schonenden Fixationsprozess mit weniger Vernetzung als PFA. Dies reduziert die Gewebesteifigkeit, reduziert den Bedarf an Antigenrückgewinnung und ermöglicht weniger konzentrierte Antikörperlösungen während der Immunfärbung. Wenn sie jedoch Methanol enthalten, kann dies dazu dienen, die Autofluoreszenz^{zu erhöhen 36}. Auf der anderen Seite ermöglicht PFA oft eine robustere Fixierung, und während während die Antigengewinnung während der Immunfärbung erforderlich ist, gibt es Antikörper, die nur mit PFA-fixiertem Gewebe arbeiten, und eine Perfusion mit 4% PFA ist für die später beschriebene optische Clearingtechnik erforderlich.

Nach der Perfusion folgt ein Post-Fixationsschritt, bei dem das Gehirn über Nacht in die gleiche Art von Fixiermittel eingetaucht wird, das während der Perfusion verwendet wird. Dies ermöglicht es allen Gehirnregionen, die während der Perfusion möglicherweise nicht vollständig fixiert wurden, sich weiter zu fixieren. Als nächstes wird das Gehirn in Saccharose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) inkubiert, um vor dem Gefrierschritt so viel Wasser wie möglich zu entfernen, um Eisbildung im Gewebe zu verhindern (“Kryokonservierung”). Gehirne können dann zur Verarbeitung in eine beliebige Anzahl von sagittalen, koronalen oder transversalen Gewebeabschnitten geschnitten werden. Sowohl für die Präzision als auch für die Reproduzierbarkeit müssen kalibrierte Gehirnblöcke so verwendet werden, dass konsistente Bregma-Schnitte zwischen Tieren gewährleistet sind. Der wichtigste Faktor, der beeinflussen kann, wie Gehirne geschnitten werden, sind die interessierenden Gehirnregionen. Zum Beispiel, während ein sagittaler Schnitt es ermöglichen kann, mehr Gehirnregionen in einem Gewebeabschnitt zu analysieren, wird dieser Schnitt keine Analyse von neuro- / gliogenen Regionen der ventrikulär-subventrikulären Zone (V-SVZ) ermöglichen, da die lateralen und medialen Seiten des lateralen Ventrikels in dieser Dimension unmöglich zu erkennen sind und besser in der koronalen Ebene beobachtet werden. Dies kann eine wichtige Unterscheidung in Studien zur adulten Neurogenese sein, da die laterale Seite des lateralen Ventrikels das neurogene V-SVZ enthält, während die mediale Wand des lateralen Ventrikels eine eher gliogene Nische³⁷ ist.

Nachdem das Gewebe in koronale, sagittale oder transversale Abschnitte unterteilt wurde, werden sie mit der Einbettungslösung Optimal Cooling Temperature (OCT) in Blöcke eingefroren. Hier werden Gehirne in diesem Einbettungsmaterial eingefroren, wobei eine Mischung aus Trockeneis und Ethanol verwendet wird. Wenn eine Dünnschnittanalyse erforderlich ist, werden Blöcke auf einem Kryostaten geschnitten und können je nach nachgeschalteter Analyse als Dünnschnitte (<20 μm) an positiv geladene Glasobjektträger haften. Glasobjektträger, die nicht aufgeladen sind, können ebenfalls verwendet werden, aber die Verwendung von ungeladenen Objektträgern kann dazu führen, dass sich Gewebe von den Objektträgern^{lösen 38}. Wenn freischwebende Gewebeschnitte mittlerer Dicke (>20 μm) erforderlich sind, werden Gewebe als frei schwebende Abschnitte gesammelt. Wenn dicke Abschnitte (0,5-4 mm) erforderlich sind, ist das Schneiden von nicht gefrorenen Hirnschnitten mit einem Vibratom erforderlich. Es ist wichtig, die Speicherunterschiede zwischen Abschnitten auf Dias, die bei -20 bis -80 ° C eingefroren werden müssen, und frei schwebenden Abschnitten, die bei 4 ° C gelagert werden, zu beachten.

Gehirn-Clearing und Whole-Mount-Immunfluoreszenz-konfokalmikroskopie
Wenn eine breitere, aber weniger detaillierte Analyse der nach der Abstammung verfolgten Zellen im Gehirn der Maus gewünscht wird, ist eine umfassende Analyse dickerer Segmente des Hirngewebes mit iDISCO brain clearing³⁹ möglich, gefolgt von Immunfärbung und gekachelter konfokaler Z-Stack-Mikroskopie oder Lichtblattmikroskopie. Hier werden große Teile des Mäusegehirns optisch gereinigt (ein Prozess der Delipidierung³⁹), was eine fluoreszierende Signalabbildung über einen 1-mm-Gewebeschnitt besser ermöglicht. Die Nachteile dieses Prozesses sind eine hohe Autofluoreszenz und eine verminderte Fähigkeit, hochauflösende Bilder der Zellmorphologie und detaillierte Co-Färbeanalysen zu erhalten, aufgrund der erhöhten Arbeitsabstände, die im Vergleich zu traditionelleren Methoden (dünne Kryosektionen oder frei schwebende Abschnitte) erforderlich sind. Aus diesem Grund empfehlen wir die Gehirnreinigung, um die groß angelegten Ergebnisse der Linienverfolgung in mehreren Gehirnbereichen zu analysieren, anstatt zu versuchen, einzelne Zellen zu charakterisieren oder zu analysieren.

Protocol

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Ohio State University genehmigt. 1. Erstellung einer Linienverfolgung der Tet-On-Mauslinie, Zuchtstrategien und Genotypisierung für experimentelle Kohortenmäuse HINWEIS: Hier beschreiben wir die Erstellung eines Tet-On-Maussystems mit Rosa-mTmG als fluoreszierendem Reportergen, das einer Cre-Rekombination unterzogen wird, aber auch verschiedene andere…

Representative Results

Während das Fluoreszenzsignal, das sich aus einem Tet-On-System mit einem fluoreszierenden Reporter ergibt, je nach Interessenträger und verwendetem Fluorophor(en) variiert, werden wir beschreiben, wie die Ergebnisse mit mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG-Tieren analysiert wurden. Die Analyse von erwachsenen Gehirnen nach einer Pulsjagd führte zu Membran-GFP-exprimierenden Zellen in verschiedenen anatomischen Nischen. Der Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen verschiedenen Zelltypen muss beachtet werden. Ein…

Discussion

Eine Methode zur Erzeugung, Nutzung und Analyse einer dreifachen transgenen Linienverfolgung von Mauslinienmarkierungsstammzellen im erwachsenen Mäusegehirn in vivo wird beschrieben. In Kombination mit Immunverfärtung oder Gehirnreinigung kann die Identifizierung und Charakterisierung von Fluoreszenzzellen im gesamten Gehirn erreicht werden. Diese Technik bietet die Fähigkeit, das plastische/regenerative/Umbaupotenzial markierter Stammzellen zu verstehen, wenn sie sich aktivieren, migrieren, differenzieren od…

Materials

Antibody diluent	Agilent	S080983-2
Antigen Retrieval Solution	Agilent	S2367
anti-GFP antibody	Invitrogen	A2311	Use at 1:500-1:000
Acetone	Fisher Scientific	A18-4
B6.Cg-Tg(tet0-cre)1Jaw/J	The Jackson Laboratory	JAX:006234
B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J	The Jackson Laboratory	JAX:007676
Blocking Solution (IHC)	Millipore Sigma	20773
Blunt needle	BSTEAN	X0012SYHIV
Coronal brain block	Braintree	BS-2000C
Cover slip	Corning	2850-22
Cryostat	Leica	CM1900
DAPI	Sigma-Aldrich	D564
Dibenzyl ether	Millipore Sigma	33630
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418
Donkey Serum	Sigma-Aldrich	D9663
Doxycycline Hyclate	Sigma-Aldrich	D9891
Glycine	Bio-Rad	161-0718
Heparin Sodium Salt from Porcine Mucosa	Sigma-Aldrich	H3393
Histochoice Molecular Biology Tissue Fixative	Amresco	H120	This product has since been discontinued, but can be replaced with Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)
Hydrogen Peroxide Solution	Sigma-Aldrich	516813
IHC Select TBS Rinse Buffer	Millipore Sigma	20845
Ketamine	Westward	0143-95095-10	This product requires a DEA license for storage and use.
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Milipore Block	Millipore	20773
Mounting medium	Millipore Sigma	5013
Optimal Cutting Temperature Solution	Sakura	4583
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
PBS Solution (10X)	Teknova	P0496
Sagittal brain block	Braintree	RBM-2000S
Saline	Braun	S8004-5264
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Sudan (Typogen) Black	Millipore Sigma	199664
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	186562
Tissue cartridge	Simport	M512
Triton X-100	Bio-Rad	1610407
Tween-20	Millipore Sigma	655205
Xylazine	AnaSed	sc-362950Rx