Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Dissektion von Maus-Fettdepots und zur Isolierung und Verdauung entsprechender Arterien, um die Endothelzellpopulation freizusetzen und dann zu identifizieren. Frisch isolierte Zellen, die in nachgeschalteten Anwendungen eingesetzt werden, werden das Verständnis der vaskulären Zellbiologie und der Mechanismen vaskulärer Dysfunktion voranbringen.
Vaskuläre Endothelzellen, die die Wand des Gefäßsystems auskleiden, spielen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von physiologischen Prozessen, einschließlich der Regulierung des Gefäßtonus, der Barrierefunktionen und der Angiogenese. Die Endothelzelldysfunktion ist ein charakteristischer Prädiktor und ein wichtiger Treiber für das Fortschreiten schwerer kardiovaskulärer Erkrankungen, aber die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch wenig verstanden. Die Fähigkeit, Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten in ihrer nativen Form zu isolieren und zu analysieren, wird einen Einblick in die Prozesse von Herz-Kreislauf-Erkrankungen geben. Dieses Protokoll stellt das Verfahren zur Dissektion von subkutanem und mesenterialem Fettgewebe der Maus vor, gefolgt von der Isolierung ihres jeweiligen arteriellen Gefäßsystems. Die isolierten Arterien werden dann mit einem spezifischen Cocktail von Verdauungsenzymen verdaut, die sich auf die Freisetzung funktionell lebensfähiger Endothelzellen konzentrieren. Das verdaute Gewebe wird mittels Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung von CD31+/CD45−-Zellen als Marker für die positive Identifizierung von Endothelzellen beurteilt. Zellen können für sofortige nachgeschaltete funktionelle Assays sortiert oder zur Erzeugung primärer Zelllinien verwendet werden. Die Technik der Isolierung und Verdauung von Arterien aus verschiedenen Gefäßbetten wird Forschern die Möglichkeit bieten, frisch isolierte Gefäßzellen aus Arterien von Interesse zu bewerten und eine breite Palette von Funktionstests an bestimmten Zelltypen durchzuführen.
Endothelzellen sind für ihre wichtige Rolle in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen bekannt, einschließlich Barrierefunktionen, Angiogenese und Gefäßtonusregulation 1,2. Obwohl die Endothelzelldysfunktion bei der Förderung von Atherosklerose, Bluthochdruck, Diabetes usw. gut dokumentiert ist, sind die zugrunde liegenden Mechanismen, die die endotheliale Dysfunktion antreiben, nach wie vor schlecht verstanden und unterscheiden sich wahrscheinlich zwischen verschiedenen Gefäßbetten 2,3,4. Die Bemühungen, diese pathologischen Mechanismen der Endothelzelldysfunktion zu entschlüsseln, werden durch den begrenzten Zugang zu einer reinen Population von Endothelzellen aus Geweben und/oder die phänotypischen Veränderungen von Endothelzellen in Kultur 5,6 in Frage gestellt. Daher wird die Möglichkeit, Endothelzellen aus verschiedenen Gefäßbetten in ihrer nativen Form zu isolieren und zu analysieren, einen Einblick in die Prozesse von Herz-Kreislauf-Erkrankungen geben.
Dieses Protokoll stellt das Verfahren zur Sezierung von subkutanem und mesenterialem Fettgewebe von Mäusen vor, gefolgt von der Isolierung ihres jeweiligen arteriellen Gefäßsystems. Funktionell lebensfähige Endothelzellen, die die Arterienwände auskleiden, werden mit einem spezifischen Enzymcocktail freigesetzt. Besondere Sorgfalt wurde darauf verwendet, die Bedingungen des Verdauungsprotokolls zu optimieren, um eine ausreichende Ausbeute an Endothelzellen aus <1 mg Ausgangsgewebe zu erhalten, während die biomolekularen Marker für die Analyse intakt bleiben. Als nächstes werden isolierte Endothelzellen mittels Durchflusszytometrie identifiziert. Das Vorhandensein von CD31 (PECAM) wird in erster Linie zur Identifizierung von Endothelzellen verwendet. Aufgrund der Expression von CD31 in anderen Zelltypen, darunter mehrere hämatopoetischen Ursprungs, die auch CD45 exprimieren, wurde die Reinheit der isolierten Endothelzellen durch den Ausschluss von Zellen, die sowohl CD31 als auch CD45exprimieren 5,6,7,8, weiter erhöht. Darüber hinaus sollten Forscher abhängig von der Forschungsfrage und den zu verwendenden nachgelagerten Anwendungen die Auswahl eines umfangreichen Panels positiver und negativer Selektionsmarker in Betracht ziehen, um die Reinheit der interessierenden Zellpopulation zu optimieren.
Obwohl die Technik der Sezierung und Isolierung von Fettdepotarterien in den früheren Publikationen 9,10,11,12,13 verwendet wurde, muss noch ein detailliertes Protokoll vorgelegt werden, das die Isolierung eingebetteter Arterien beschreibt. Die Demonstration der Technik zur Isolierung und Verdauung von Arterien aus verschiedenen Gefäßbetten einer bestimmten Art von Interesse wird Forschern die Möglichkeit bieten, frisch isolierte Gefäßzellen aus Arterien von Interesse zu bewerten und eine breite Palette von Funktionstests an bestimmten Zelltypen durchzuführen. Die Tests können unter anderem Durchflusszytometrie zur Zellsortierung und Membranproteinexpression5,8, Elektrophysiologie zur Ionenkanalaktivität9, molekulares Profiling (Proteomik/genomische Analysen usw.) umfassen. 14,15 und die Erzeugung primärer Zelllinien für das Wirkstoffscreening in vitro16,17.
Endotheliale Dysfunktion ist ein Vorläufer schwerer Krankheitszustände, die wahrscheinlich die Entwicklung von Atherosklerose, Bluthochdruck und Schlaganfall vorantreiben 3,23. Während die identifizierten Mechanismen, die der endothelialen Dysfunktion in einem bestimmten pathologischen Zustand zugrunde liegen, vielfältig sind, werden unterschiedliche Gefäßbetten wahrscheinlich differentiell durch pathologische Zustände beeinflusst 4,24. Darüber hinaus induzieren verschiedene kardiovaskuläre Risikofaktoren (z. B. Fettleibigkeit, Bluthochdruck, Dyslipidämie, Rauchen, Diabetes) Funktionsstörungen durch eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen23,25. Daher ist es wichtig, Endothelzellpopulationen aus etablierten Tiermodellen von Krankheiten oder zugänglichem menschlichem Gewebe zu isolieren und Assays an Zellen durchzuführen, die unmittelbar aus der In-vivo-Umgebung entfernt wurden. Die Isolierung von Zellen auf diese Weise hat einen einzigartigen Vorteil gegenüber der Untersuchung von Zellen in Kultur, da sie frei von kulturinduzierten phänotypischen Veränderungen sind 5,6. Darüber hinaus informiert die Einbeziehung einer heterogenen Endothelzellpopulation, wie sie in vivo 26,27 beobachtet wurde (und die durch flussunterstützte Zellsortierung weiter getrennt werden kann), von einem lebenden Organismus die In-vivo-Umgebung besser. Schließlich ist diese Methode auf die Untersuchung zahlreicher Tiermodelle und möglicherweise menschlicher Gewebe anwendbar und kann zur Erzeugung primärer Zellkulturlinien verwendet werden, wenn ein solcher Bedarf gerechtfertigt ist.
Der kritische Schritt in diesem Protokoll und der Schritt, der am meisten für verschiedene Gefäßbetten oder Zelltypen angepasst werden muss, die hier nicht vorgestellt werden, ist die Verdauung von vaskulärem Gewebe. Dieser Schritt muss für die Zellgesundheit optimiert werden, ohne die Zellausbeute zu verringern. Die verwendeten spezifischen Enzyme und die Dauer der Verdauung sind entscheidend für die Optimierung der Zellgesundheit und des Zellertrags, um nachgeschaltete Assays adäquat durchführen zu können. Für die Identifizierung der Membranexpression von CD36, wie sie durch Durchflusszytometrie in subkutanen und mesenterialen Endothelzellen nachgewiesen wurde (Abbildung 4), wurde eine modifizierte Version des ursprünglich für die Patch-Clamp-Elektrophysiologie28 konzipierten Aufschlussprotokolls entwickelt. Dies beinhaltete eine Verlängerung der Kollagenase-I-Verdauungszeit auf 30 Minuten, um die Zellausbeute zu erhöhen und die Anforderungen der Durchflusszytometrie besser zu erfüllen, verglichen mit dem, was für Patch-Clamp-Studien erforderlich ist. Da diese Modifikation die Zellgesundheit bis zu einem gewissen Grad beeinträchtigen kann, wurde in den Durchflusszytometrie-Analysen eine Zelllebensfähigkeitsfärbung verwendet, um sicherzustellen, dass nur lebensfähige Endothelzellen nach diesem Protokoll bewertet wurden (Abbildung 3). Es wird empfohlen, dass Studien, die darauf abzielen, Zellen aus vaskulärem Gewebe zu isolieren, vor der Bewertung des gewünschten Ansatzes einen Marker für die Zelllebensfähigkeit enthalten sollten.
Das beschriebene Protokoll reicht aus, um lebensfähige Endothelzellen für Analysen und nachgeschaltete Anwendungen aus ≤1 mg arteriellen Proben von Mäusen freizusetzen; Wenn jedoch die interessierenden Arterien aus verschiedenen Geweben oder Organismen (z. B. Menschen) isoliert würden, was zu signifikant unterschiedlichen arteriellen Massen führen würde, müsste man den Verdauungsenzymgehalt und die Dauer der Inkubation optimieren, um die interessierende Zellpopulation effizient zu isolieren. Für einige Gefäßbetten, die mit noch kleineren Mengen an Ausgangsgewebe beginnen als die hier vorgestellten subkutanen und mesenterialen Betten (z. B. Koronararterien), kann eine Ansammlung von Arterien aus mehreren Mäusen pro Probe erforderlich sein. In der Tat kann dies ein notwendiger Schritt für jedes gegebene Gefäßbett sein, da der Ergebnisansatz eine relativ hohe Zellausbeute erfordert. Eine wesentliche Einschränkung besteht darin, dass aufgrund der Art der Schwankungen pro Probenaufschluss die Zellausbeuten manchmal zwischen den Chargen signifikant unterschiedlich sein können, selbst wenn sie aus demselben Gefäßbett stammen. Dies kann zu Problemen bei der Analyse von Daten führen und sollte gegebenenfalls durch Normalisierung berücksichtigt werden. Zum Beispiel war die CD36-Expression in den Rohdaten aufgrund von Veränderungen der Zellausbeute über einzelne Proben subkutaner und mesenterialer Fettarterien extrem variabel. Daher wurden die Rohdaten auf die mittlere Fluoreszenzintensität von CD31+CD45− normalisiert, wobei davon ausgegangen wurde, dass diese Methode Chargenunterschiede korrigieren würde (Abbildung 4). Natürlich können je nach Ansatz anspruchsvollere statistische Analysen und Normalisierungsmethoden erforderlich sein.
Zusammenfassend stellt dieser Artikel eine Methode vor, um subkutane und mesenteriale Arterien von Mäusen zu sezieren, zu isolieren und zu verdauen, um die Expression und / oder Funktion von endothelialen Zielen von Interesse zu untersuchen. Mit Modifikationen des vorgestellten Protokolls können verschiedene Gefäßbetten und Zelltypen (z.B. glatte Muskelzellen) untersucht werden. Dieses Protokoll, als Grundlage für eine Vielzahl verfügbarer experimenteller Ansätze, hat das Potenzial, das Verständnis der vaskulären Zellbiologie und der Mechanismen vaskulärer Dysfunktion voranzutreiben.
The authors have nothing to disclose.
In liebevoller Erinnerung an Rich West, einen brillanten Wissenschaftler, Kollegen und lieben Freund. Wir möchten der University of Delaware Flow Cytometry and BioImaging Core als Teil des Delaware Biotechnology Institute für ihre laufenden Beiträge zu unseren Studien danken. Wir danken auch Emma Hudgins für die sorgfältige Sichtung und Bearbeitung des Manuskripts. Unsere Arbeit wird vom National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher) unterstützt. Dieses Projekt wurde auch vom Delaware INBRE-Programm unterstützt, mit einem Zuschuss des NIGMS (P20GM103446) von den National Institutes of Health und dem Bundesstaat Delaware (I.S. Fancher) und einem University of Delaware General University Research Grant (I.S. Fancher). Dieser Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der NIH dar.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |