Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae
Summary
Wir beschreiben eine qualitative Tests für Hefe Haftung und Agar-Invasion als Maß für die invasive und pseudohyphal Differenzierung. Dieser einfache Test kann verwendet werden, um den invasiven Phänotyp der verschiedenen Mutanten sowie die Auswirkungen Umweltreize zu bewerten und Signalwege auf Hefe Differenzierung.
Abstract
Hefen sind in natürlichen Biofilmen, wo viele Mikroorganismen besiedeln Oberflächen gefunden. In künstlichen Umgebungen, wie z. B. Oberflächen von künstlichen Objekten können Biofilme vermindern die Produktivität der Industrie, zu zerstören Strukturen und bedrohen Menschenleben. 1-3 auf der anderen Seite kann sich die Leistung von Biofilmen zu helfen reinigen Sie die Umwelt und die Erzeugung nachhaltiger Energie. 4-8 Die Fähigkeit von S. cerevisiae, um Oberflächen zu besiedeln und an komplexen Biofilmen wurde meist bis zur Wiederentdeckung der Differenzierung Programme von verschiedenen Signalwegen und Umweltreize in diesem Organismus ausgelöst ignoriert. 9, 10 Die anhaltende Interesse an der Verwendung von S. cerevisiae als Modellorganismus, um das Zusammenspiel und die Konvergenz der Signalwege, wie die Ras-PKA, KSS1 MAPK und Hog1 Osmolarität Wege, schnell platziert S. cerevisiae in der Kreuzung der Biofilm verstehen Biologie und Signaltransduktion Forschung. 11-20 Zu diesem Zweck wurde die Differenzierung von Hefezellen in lange, Kleber, pseudohyphal Filamente eine bequeme Ablesung für die Aktivierung der Signalwege auf verschiedene Veränderungen der Umwelt. Allerdings ist Filamentierung eine komplexe Sammlung von Phänotypen, die für ihn Testen macht, als ob es eine einfache Phänotyp irreführend waren. In den letzten zehn Jahren wurden mehrere Tests erfolgreich von bakterieller Biofilm Studien zur Hefe Forschung, wie MAT Bildung Assays zur Kolonie verteilt auf weichem Agar und Kristallviolettfärbung quantitativ zu messen Zelloberfläche Einhaltung getroffene Maßnahme. 12, 21 Allerdings gab es einige Verwirrung in Assays entwickelt, um qualitativ bewerten die Klebstoff-und invasive Phänotypen der Hefe in Agar. Hier präsentieren wir eine einfache und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Klebstoff-und invasive Qualität der Hefestämme mit leicht verständlichen Schritten, um die Haftung Beurteilung der Invasion Beurteilung zu isolieren. Unsere Methode, aus früheren Studien, 10, 16 angenommen beinhaltet wachsenden Zellen in flüssigen Medien und Plattierung auf Differential Nährstoff Bedingungen für das Wachstum von großen Flecken, die wir dann mit Wasser zu waschen, um die Haftung zu beurteilen und reiben Zellen vollständig von der Agar-Oberfläche zur Invasion in beurteilen Agar. Wir beseitigen die Notwendigkeit für Schlieren Zellen auf Agar, der die Invasion von Zellen wirkt sich in den Agar. In der Regel beobachteten wir, dass haploide Stämme, die Agar-Invasion immer Kleber, aber nicht alle Kleber Stämme können Agarmedium einzudringen. Unser Ansatz kann in Verbindung mit anderen Assays verwendet werden, um sorgfältig zu sezieren die Differenzierung Schritte und Anforderungen der Hefe Signaltransduktion, Differenzierung, Quorum Sensing und Biofilmbildung.
Protocol
Discussion
Hefezellen zeigen verschiedene Modi Differenzierung nach Verfügbarkeit von Nährstoffen und ökologischen Bedingungen, einschließlich Sporenbildung unter Hunger und Stress-Bedingungen, Filamentierung unter verschiedenen Nährstoffen betont, und Flockung. Verschiedene Hefen, einschließlich S. cerevisiae und C. albicans, kann auch in Biofilmen durch eine vielfältige Reihe von Mikroorganismen gebildet gefunden werden. Zwar gibt es eine gewisse Korrelation mit Filamentierung und invasive Verhalten, es ist nicht klar, wie Filamentierung kön…
Acknowledgements
Wir möchten Lisa Schneper und Katrin Duevel für ihre Einsichten danken bei der Entwicklung dieses Tests.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Moticam 350 | Camera | Motic | discontinued (new model: Moticam 352) | A relatively cheap camera that attaches to eye pieces of microscopes and captures digital images for PC or Mac. |
References
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Elortondo, F. J. P., Salmeron, J., Albisu, M., Casas, C. Biofilms in the food industry. Food Science and Technology International. 5, 25-30 (1999).
- Keinanen, M. M., Martikainen, P. J., Kontro, M. H. Microbial community structure and biomass in developing drinking water biofilms. Can J Microbiol. 50, 183-191 (2004).
- Biffinger, J. C., Pietron, J., Ray, R., Little, B., Ringeisen, B. R. A biofilm enhanced miniature microbial fuel cell using Shewanella oneidensis DSP10 and oxygen reduction cathodes. Biosens Bioelectron. 22, 1672-1679 (2007).
- Kim, G. T. Bacterial community structure, compartmentalization and activity in a microbial fuel cell. J Appl Microbiol. 101, 698-710 (2006).
- Kim, J. R., Jung, S. H., Regan, J. M., Logan, B. E. Electricity generation and microbial community analysis of alcohol powered microbial fuel cells. Bioresour Technol. 98, 2568-2577 (2007).
- Picioreanu, C., Head, I. M., Katuri, K. P., Loosdrecht, M. C. v. a. n., Scott, K. A computational model for biofilm-based microbial fuel cells. Water Res. 41, 2921-2940 (2007).
- Singh, R., Paul, D., Jain, R. K. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14, 389-397 (2006).
- Cullen, P. J., Sprague, G. F. Glucose depletion causes haploid invasive growth in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13619-13224 (2000).
- Gimeno, C. J., Ljungdahl, P. O., Styles, C. A., Fink, G. R. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. 68, 1077-1090 (1992).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 9, 588-594 (2006).
- Reynolds, T. B., Fink, G. R. Bakers’ yeast, a model for fungal biofilm formation. Science. 291, 878-881 (2001).
- Verstrepen, K. J., Klis, F. M. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol. 60, 5-15 (2006).
- Liu, H., Styles, C. A., Fink, G. R. Elements of the yeast pheromone response pathway required for filamentous growth of diploids. Science. 262, 1741-1744 (1993).
- Madhani, H. D., Fink, G. R. The control of filamentous differentiation and virulence in fungi. Trends Cell Biol. 8, 348-353 (1998).
- Mosch, H. U., Kubler, E., Krappmann, S., Fink, G. R., Braus, G. H. Crosstalk between the Ras2p-controlled mitogen-activated protein kinase and cAMP pathways during invasive growth of Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 10, 1325-1335 (1999).
- Mosch, H. U., Roberts, R. L., Fink, G. R. Ras2 signals via the Cdc42/Ste20/mitogen-activated protein kinase module to induce filamentous growth in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5352-5356 (1996).
- Pan, X., Heitman, J. Cyclic AMP-dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 19, 4874-4887 (1999).
- Roberts, R. L., Fink, G. R. Elements of a single MAP kinase cascade in Saccharomyces cerevisiae mediate two developmental programs in the same cell type: mating and invasive growth. Genes Dev. 8, 2974-2985 (1994).
- Robertson, L. S., Fink, G. R. The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13783-13787 (1998).
- Reynolds, T. B., Jansen, A., Peng, X., Fink, G. R. Mat formation in Saccharomyces cerevisiae requires nutrient and pH gradients. Eukaryot Cell. , (2007).
