Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste dødsårsag på verdensplan. Vaskulær forkalkning bidrager væsentligt til byrden af kardiovaskulær sygelighed og dødelighed. Denne protokol beskriver en simpel metode til kvantificering af vaskulær glat muskelcellemedieret calciumudfældning in vitro ved fluorescerende billeddannelse.
Vaskulær forkalkning involverer en række degenerative patologier, herunder inflammation, ændringer i cellulær fænotype, celledød og fravær af forkalkningshæmmere, der samtidig fører til tab af karelasticitet og funktion. Vaskulær forkalkning er en vigtig bidragyder til sygelighed og dødelighed i mange patologier, herunder kronisk nyresygdom, diabetes mellitus og aterosklerose. Nuværende forskningsmodeller til undersøgelse af vaskulær forkalkning er begrænsede og er kun levedygtige i de sene stadier af forkalkningsudvikling in vivo. In vitro-værktøjer til undersøgelse af vaskulær forkalkning bruger slutpunktsmålinger, hvilket øger kravene til biologisk materiale og risikerer at indføre variabilitet i forskningsundersøgelser. Vi demonstrerer anvendelsen af en ny fluorescerende mærket sonde, der binder til in vitro-forkalkningsudvikling på humane vaskulære glatte muskelceller og bestemmer realtidsudviklingen af in vitro-forkalkning. I denne protokol beskriver vi anvendelsen af vores nyudviklede forkalkningsassay, et nyt værktøj inden for sygdomsmodellering, der har potentielle translationelle anvendelser. Vi forestiller os, at denne analyse er relevant i et bredere spektrum af mineralaflejringsforskning, herunder anvendelser inden for knogle-, brusk- eller tandforskning.
Vaskulær forkalkning (VC) er en uafhængig risikofaktor for kardiovaskulær sygelighed og dødelighed 1,2,3. Længe betragtet som en passiv kemisk proces med ektopisk mineralaflejring, ser det nu ud til at være et modificerbart vævshelingsrespons, der involverer det aktive bidrag fra forskellige celler, herunder aktiverede vaskulære glatte muskelceller (hVSMC) som en drivkraft for sygdommen 4,5. In vivo VC kan måles ved multislice CT-scanninger som en vurdering af aterosklerotisk byrde 6,7,8. I øjeblikket er et paradigmeskift i gang, hvor VC-sværhedsgrad bliver anerkendt som en risikofaktor i hjerte-kar-sygdomme, type II-diabetes, kronisk nyresygdom og aldring 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC’er er den mest rigelige celletype i det kardiovaskulære system og en hovedaktør i udviklingen af VC. In vitro hVSMC-induceret forkalkning er en meget anvendt sygdomsmodel til at studere hjerte-kar-sygdomme16,17. Imidlertid bruger de fleste protokoller til påvisning af in vitro-forkalkning slutpunktsmålinger, der kan begrænse dataindsamling, kræver større brug af cellulært materiale og kan bremse forskningen. Almindelige metoder til påvisning af in vitro hVSMC-forkalkning omfatter o-cresolphthalein-assayet, som måler opløselig calciumaflejring mod total protein og kræver cellelyse18. Alizarin Red farvning anvendes også, som binder direkte til calciumaflejringer på faste celler eller væv19. At studere hVSMC-forkalkning over tid med enten o-cresolphthalein eller Alizarin Red kræver partier af replikater pr. Tidspunkt, hvilket øger efterspørgslen efter biologisk materiale og igen øger chancen for variabilitet.
I dette papir beskriver vi metoden til anvendelse af et nyt assay, der anvender hVSMC’er med en fluorescerende billedsonde til at bestemme in vitro VC-progression samt fungere som et enestående forkalkningsassay i slutstadiet. Vi har tidligere vist, at dette assay er direkte sammenligneligt med o-cresolphthalein og Alizarin Red metoderne og kan bruges til at skelne mellem varierende kulturforhold20. Ud over realtidsmålinger kan dette assay bruges til at bestemme tilbøjeligheden af serum- eller plasmaprøver som en surrogatmarkør til klinisk VC-udvikling20. Dette vil hjælpe med anvendelsen af biologiske strategier for kardiovaskulær videnskab og sygdomsmodellering. En yderligere anvendelse af analysen kan være som et translationelt BioHybrid-system til vurdering af VC-sværhedsgrad eller progression fra blodbestanddele såsom serum eller plasma.
I dette manuskript beskriver vi en halvautomatisk metode til in vitro-forkalkningsbestemmelse . Til denne metode skal tre kritiske trin i hVSMC-forkalkning optimeres. For det første er cellulær tæthed afgørende for udviklingen af hVSMC-forkalkning. Lave tætheder af hVSMC’er vil resultere i langsom eller ingen forkalkning og celledød på grund af manglen på celle-til-celle-kontakt og den stress, der induceres under forkalkningsforhold21. Høje cellulære tætheder resulterer i overk…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev finansieret af EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogrammer under Marie Sklodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 722609 og 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Denne forskning blev støttet af BioSPX. WJ-D modtog støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) TRR219-project ID 322900939 og project ID 403041552
Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |