Un método biológico semiautomatizado y reproducible para cuantificar la deposición de calcio in vitro
Summary
Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en todo el mundo. La calcificación vascular contribuye sustancialmente a la carga de morbilidad y mortalidad cardiovascular. Este protocolo describe un método simple para cuantificar la precipitación de calcio mediada por células del músculo liso vascular in vitro mediante imágenes fluorescentes.
Abstract
La calcificación vascular implica una serie de patologías degenerativas, que incluyen inflamación, cambios en el fenotipo celular, muerte celular y ausencia de inhibidores de la calcificación, que concomitantemente conducen a una pérdida de elasticidad y función de los vasos. La calcificación vascular es un importante contribuyente a la morbilidad y mortalidad en muchas patologías, incluida la enfermedad renal crónica, la diabetes mellitus y la aterosclerosis. Los modelos de investigación actuales para estudiar la calcificación vascular son limitados y solo son viables en las últimas etapas del desarrollo de la calcificación in vivo. Las herramientas in vitro para estudiar la calcificación vascular utilizan mediciones de punto final, lo que aumenta las demandas de material biológico y corre el riesgo de introducir variabilidad en los estudios de investigación. Demostramos la aplicación de una nueva sonda marcada con fluorescencia que se une al desarrollo de calcificación in vitro en células del músculo liso vascular humano y determina el desarrollo en tiempo real de la calcificación in vitro . En este protocolo, describimos la aplicación de nuestro ensayo de calcificación recientemente desarrollado, una herramienta novedosa en el modelado de enfermedades que tiene posibles aplicaciones traslacionales. Prevemos que este ensayo es relevante en un espectro más amplio de investigación de deposición mineral, incluidas las aplicaciones en la investigación ósea, cartílago o dental.
Introduction
La calcificación vascular (VC) es un factor de riesgo independiente para la morbimortalidad cardiovascular 1,2,3. Considerado durante mucho tiempo un proceso químico pasivo de deposición mineral ectópica, ahora aparece una respuesta de curación tisular modificable que involucra la contribución activa de varias células, incluidas las células activadas del músculo liso vascular (hVSMC) como impulsor de la enfermedad 4,5. In vivo La VC puede ser medida por tomografía computarizada multicorte como una evaluación de la carga aterosclerótica 6,7,8. Actualmente, se está produciendo un cambio de paradigma, en el que la gravedad de la VC se está reconociendo como un factor de riesgo en la enfermedad cardiovascular, la diabetes tipo II, la enfermedad renal crónica y el envejecimiento 9,10,11,12,13,14,15.
Los hVSMC son el tipo de célula más abundante en el sistema cardiovascular y un actor principal en el desarrollo de VC. La calcificación inducida por hVSMC in vitro es un modelo de enfermedad ampliamente utilizado para estudiar la enfermedad cardiovascular16,17. Sin embargo, la mayoría de los protocolos para la detección de calcificación in vitro utilizan mediciones de punto final que pueden limitar la adquisición de datos, requieren un mayor uso de material celular y pueden retrasar la investigación. Los métodos comunes para la detección de calcificación in vitro de hVSMC incluyen el ensayo de o-cresolftaleína, que mide la deposición de calcio solubilizado contra la proteína total y requiere lisis celular18. Además, se utiliza la tinción Alizarin Red, que se une directamente a los depósitos de calcio en células o tejidos fijos19. Para estudiar la calcificación de hVSMC a lo largo del tiempo con o-cresolftaleína o rojo de alizarina se requieren lotes de réplicas por punto de tiempo, lo que aumenta la demanda de material biológico y, a su vez, aumenta la posibilidad de variabilidad.
En este documento, detallamos el método para la aplicación de un nuevo ensayo que utiliza hVSMC con una sonda de imagen fluorescente para determinar la progresión in vitro de VC, así como la función como un ensayo de calcificación de etapa terminal singular. Anteriormente demostramos que este ensayo es directamente comparable a los métodos de o-cresolftaleína y rojo de alizarina y puede usarse para distinguir entre condiciones de cultivo variables20. Además de las mediciones en tiempo real, este ensayo puede ser utilizado para determinar la propensión de las muestras de suero o plasma como marcador sustituto para el desarrollo clínico de VC20. Esto ayudará en la aplicación de estrategias biológicas de ciencias cardiovasculares y modelado de enfermedades. Una aplicación adicional del ensayo puede ser como un sistema BioHybrid traslacional para evaluar la gravedad o progresión de VC a partir de componentes sanguíneos como suero o plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este manuscrito, describimos un método semiautomatizado para la determinación de calcificación in vitro . Para este método, se deben optimizar tres pasos críticos de calcificación de hVSMC. En primer lugar, la densidad celular es crítica para el desarrollo de la calcificación de hVSMC. Las bajas densidades de hVSMCs resultarán en calcificación lenta o nula y muerte celular debido a la falta de contacto célula a célula y al estrés inducido en condiciones calcificantes21. La…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por los programas de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención Marie Sklodowska-Curie No 722609 and 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Esta investigación fue apoyada por BioSPX. WJ-D recibió fondos de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) TRR219-ID de proyecto 322900939 e ID de proyecto 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
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