En semi-automatiseret og reproducerbar biologisk baseret metode til kvantificering af calciumaflejring in vitro
Summary
Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste dødsårsag på verdensplan. Vaskulær forkalkning bidrager væsentligt til byrden af kardiovaskulær sygelighed og dødelighed. Denne protokol beskriver en simpel metode til kvantificering af vaskulær glat muskelcellemedieret calciumudfældning in vitro ved fluorescerende billeddannelse.
Abstract
Vaskulær forkalkning involverer en række degenerative patologier, herunder inflammation, ændringer i cellulær fænotype, celledød og fravær af forkalkningshæmmere, der samtidig fører til tab af karelasticitet og funktion. Vaskulær forkalkning er en vigtig bidragyder til sygelighed og dødelighed i mange patologier, herunder kronisk nyresygdom, diabetes mellitus og aterosklerose. Nuværende forskningsmodeller til undersøgelse af vaskulær forkalkning er begrænsede og er kun levedygtige i de sene stadier af forkalkningsudvikling in vivo. In vitro-værktøjer til undersøgelse af vaskulær forkalkning bruger slutpunktsmålinger, hvilket øger kravene til biologisk materiale og risikerer at indføre variabilitet i forskningsundersøgelser. Vi demonstrerer anvendelsen af en ny fluorescerende mærket sonde, der binder til in vitro-forkalkningsudvikling på humane vaskulære glatte muskelceller og bestemmer realtidsudviklingen af in vitro-forkalkning. I denne protokol beskriver vi anvendelsen af vores nyudviklede forkalkningsassay, et nyt værktøj inden for sygdomsmodellering, der har potentielle translationelle anvendelser. Vi forestiller os, at denne analyse er relevant i et bredere spektrum af mineralaflejringsforskning, herunder anvendelser inden for knogle-, brusk- eller tandforskning.
Introduction
Vaskulær forkalkning (VC) er en uafhængig risikofaktor for kardiovaskulær sygelighed og dødelighed 1,2,3. Længe betragtet som en passiv kemisk proces med ektopisk mineralaflejring, ser det nu ud til at være et modificerbart vævshelingsrespons, der involverer det aktive bidrag fra forskellige celler, herunder aktiverede vaskulære glatte muskelceller (hVSMC) som en drivkraft for sygdommen 4,5. In vivo VC kan måles ved multislice CT-scanninger som en vurdering af aterosklerotisk byrde 6,7,8. I øjeblikket er et paradigmeskift i gang, hvor VC-sværhedsgrad bliver anerkendt som en risikofaktor i hjerte-kar-sygdomme, type II-diabetes, kronisk nyresygdom og aldring 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC’er er den mest rigelige celletype i det kardiovaskulære system og en hovedaktør i udviklingen af VC. In vitro hVSMC-induceret forkalkning er en meget anvendt sygdomsmodel til at studere hjerte-kar-sygdomme16,17. Imidlertid bruger de fleste protokoller til påvisning af in vitro-forkalkning slutpunktsmålinger, der kan begrænse dataindsamling, kræver større brug af cellulært materiale og kan bremse forskningen. Almindelige metoder til påvisning af in vitro hVSMC-forkalkning omfatter o-cresolphthalein-assayet, som måler opløselig calciumaflejring mod total protein og kræver cellelyse18. Alizarin Red farvning anvendes også, som binder direkte til calciumaflejringer på faste celler eller væv19. At studere hVSMC-forkalkning over tid med enten o-cresolphthalein eller Alizarin Red kræver partier af replikater pr. Tidspunkt, hvilket øger efterspørgslen efter biologisk materiale og igen øger chancen for variabilitet.
I dette papir beskriver vi metoden til anvendelse af et nyt assay, der anvender hVSMC’er med en fluorescerende billedsonde til at bestemme in vitro VC-progression samt fungere som et enestående forkalkningsassay i slutstadiet. Vi har tidligere vist, at dette assay er direkte sammenligneligt med o-cresolphthalein og Alizarin Red metoderne og kan bruges til at skelne mellem varierende kulturforhold20. Ud over realtidsmålinger kan dette assay bruges til at bestemme tilbøjeligheden af serum- eller plasmaprøver som en surrogatmarkør til klinisk VC-udvikling20. Dette vil hjælpe med anvendelsen af biologiske strategier for kardiovaskulær videnskab og sygdomsmodellering. En yderligere anvendelse af analysen kan være som et translationelt BioHybrid-system til vurdering af VC-sværhedsgrad eller progression fra blodbestanddele såsom serum eller plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette manuskript beskriver vi en halvautomatisk metode til in vitro-forkalkningsbestemmelse . Til denne metode skal tre kritiske trin i hVSMC-forkalkning optimeres. For det første er cellulær tæthed afgørende for udviklingen af hVSMC-forkalkning. Lave tætheder af hVSMC’er vil resultere i langsom eller ingen forkalkning og celledød på grund af manglen på celle-til-celle-kontakt og den stress, der induceres under forkalkningsforhold21. Høje cellulære tætheder resulterer i overk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev finansieret af EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogrammer under Marie Sklodowska-Curie-tilskudsaftale nr. 722609 og 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Denne forskning blev støttet af BioSPX. WJ-D modtog støtte fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) TRR219-project ID 322900939 og project ID 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O’Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
