de vitroでカルシウム沈着を定量するための半自動化された再現性のある生物学的ベースの方法
Summary
心血管疾患は、世界中の主要な死因です。血管石灰化は、心血管の罹患率と死亡率の負担に大きく貢献します。.このプロトコルは、蛍光イメージングによって血管平滑筋細胞媒介カルシウム沈殿 をin vitro で定量化する簡単な方法を記載しています。
Abstract
血管石灰化は、炎症、細胞表現型の変化、細胞死、石灰化阻害剤の欠如を含む一連の変性病理を含み、同時に血管の弾力性および機能の喪失をもたらす。血管石灰化は、慢性腎臓病、真性糖尿病、アテローム性動脈硬化症など、多くの病状における罹患率と死亡率の重要な原因です。血管石灰化を研究するための現在の研究モデルは限られており、in vivoでの石灰化発生の後期段階でのみ実行可能です。血管石灰化を研究するためのin vitroツールは、エンドポイント測定を使用し、生物学的材料に対する要求を高め、研究研究にばらつきを導入するリスクを冒します。ヒト血管平滑筋細胞上でのin vitro石灰化発生に結合し、in vitro石灰化のリアルタイム発生を決定する新しい蛍光標識プローブの応用を実証します。このプロトコルでは、トランスレーショナルアプリケーションの可能性を秘めた疾患モデリングの新しいツールである、新しく開発された石灰化アッセイのアプリケーションについて説明します。このアッセイは、骨、軟骨、歯科研究への応用を含む、より幅広い鉱物沈着研究に関連すると想定しています。
Introduction
血管石灰化(VC)は、心血管の罹患率と死亡率の独立した危険因子です1,2,3。長い間、異所性ミネラル沈着の受動的な化学プロセスと考えられていましたが、現在では、疾患のドライバーとして活性化血管平滑筋細胞(hVSMC)を含むさまざまな細胞の積極的な寄与を含む修正可能な組織治癒応答のように見えます4,5。生体内VCは、アテローム性動脈硬化性負荷の評価としてマルチスライスCTスキャンによって測定することができる6、7、8。現在、VCの重症度が心血管疾患、II型糖尿病、慢性腎臓病、および老化9,10,11,12,13,14,15の危険因子として認識されるようになるというパラダイムシフトが進行中です。
hVSMCは、心血管系で最も豊富な細胞型であり、VCの発生における主要なアクターです。in vitro hVSMC誘発石灰化は、心血管疾患の研究に広く使用されている疾患モデルです16,17。ただし、in vitro石灰化の検出のためのほとんどのプロトコルは、データ収集を制限し、細胞物質のより多くの使用を必要とし、研究を遅らせる可能性のあるエンドポイント測定を使用します。in vitro hVSMC石灰化を検出するための一般的な方法には、総タンパク質に対する可溶化カルシウム沈着を測定し、細胞溶解を必要とするo-クレゾルフタレインアッセイが含まれます18。また、アリザリンレッド染色が使用され、これは固定された細胞または組織19上のカルシウム沈着物に直接結合する。o-クレゾルフタレインまたはアリザリンレッドのいずれかでhVSMC石灰化を経時的に研究するには、時点ごとに反復のバッチが必要であり、生物学的材料の需要が増加し、ひいては変動の可能性が高まります。
本論文では、蛍光イメージングプローブを用いたhVSMCsを利用して、 in vitro VCの進行を決定し、特異な末期石灰化アッセイとして機能する新しいアッセイの適用方法について詳しく説明します。我々は以前に、このアッセイがo-クレゾルフタレインおよびアリザリンレッド法に直接匹敵し、さまざまな培養条件を区別するために使用できることを実証しました20。リアルタイム測定に加えて、このアッセイは、臨床VC開発のための代理マーカーとしての血清または血漿サンプルの傾向を決定するために使用され得る20。これは、心臓血管科学と疾患モデリングの生物学的戦略の適用に役立ちます。アッセイのさらなる用途は、血清または血漿などの血液成分からのVC重症度または進行を評価するためのトランスレーショナルバイオハイブリッドシステムとしてであり得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では, in vitro 石灰化判定のための半自動法について述べる。この方法では、hVSMC石灰化の3つの重要なステップを最適化する必要があります。まず、細胞密度はhVSMC石灰化の発生に重要です。hVSMCの密度が低いと、細胞間接触の欠如と石灰化条件下で誘発されるストレスにより、石灰化が遅いかまったくないか、細胞死が発生します21。細胞密度が高いと過剰コンフ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、マリー・スクロドフスカ・キュリー助成金契約第722609 764474号、NWO ZonMw(MKMD 40-42600-98-13007)に基づく欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラムによって資金提供されました。この研究はBioSPXの支援を受けました。WJ-Dは、ドイツ研究財団(DFG)から資金提供を受けました TRR219-プロジェクトID 322900939およびプロジェクトID 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O’Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
