En halvautomatiserad och reproducerbar biologisk baserad metod för att kvantifiera kalciumdeposition in vitro
Summary
Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste dödsorsaken i världen. Vaskulär förkalkning bidrar väsentligt till bördan av kardiovaskulär sjuklighet och dödlighet. Detta protokoll beskriver en enkel metod för att kvantifiera vaskulär glattmuskelcellmedierad kalciumutfällning in vitro genom fluorescerande avbildning.
Abstract
Vaskulär förkalkning involverar en serie degenerativa patologier, inklusive inflammation, förändringar i cellulär fenotyp, celldöd och frånvaron av förkalkningshämmare, som samtidigt leder till förlust av kärlelasticitet och funktion. Vaskulär förkalkning är en viktig bidragsgivare till sjuklighet och dödlighet i många patologier, inklusive kronisk njursjukdom, diabetes mellitus och åderförkalkning. Nuvarande forskningsmodeller för att studera vaskulär förkalkning är begränsade och är endast livskraftiga i de sena stadierna av förkalkningsutveckling in vivo. In vitro-verktyg för att studera vaskulär förkalkning använder slutpunktsmätningar, vilket ökar kraven på biologiskt material och riskerar att införa variabilitet i forskningsstudier. Vi demonstrerar tillämpningen av en ny fluorescerande märkt sond som binder till in vitro-förkalkningsutveckling på humana vaskulära glattmuskelceller och bestämmer realtidsutvecklingen av in vitro-förkalkning. I detta protokoll beskriver vi tillämpningen av vår nyutvecklade förkalkningsanalys, ett nytt verktyg inom sjukdomsmodellering som har potentiella translationella tillämpningar. Vi föreställer oss att denna analys är relevant i ett bredare spektrum av mineraldepositionsforskning, inklusive tillämpningar inom ben-, brosk- eller tandforskning.
Introduction
Vaskulär förkalkning (VC) är en oberoende riskfaktor för kardiovaskulär sjuklighet och dödlighet 1,2,3. Länge betraktad som en passiv kemisk process av ektopisk mineralavsättning, verkar det nu vara ett modifierbart vävnadsläkningssvar som involverar det aktiva bidraget från olika celler inklusive aktiverade vaskulära glattmuskelceller (hVSMC) som en drivkraft för sjukdomen 4,5. In vivo VC kan mätas med flerdelade CT-skanningar som en bedömning av aterosklerotisk börda 6,7,8. För närvarande pågår ett paradigmskifte, där VC-svårighetsgrad blir erkänd som en riskfaktor vid hjärt-kärlsjukdom, typ II-diabetes, kronisk njursjukdom och åldrande 9,10,11,12,13,14,15.
hVSMC är den vanligaste celltypen i hjärt-kärlsystemet och en huvudaktör i utvecklingen av VC. In vitro hVSMC-inducerad förkalkning är en allmänt använd sjukdomsmodell för att studera hjärt-kärlsjukdom16,17. De flesta protokoll för detektion av de vitro-förkalkning använder dock slutpunktsmätningar som kan begränsa datainsamling, kräver större användning av cellulärt material och kan sakta ner forskningen. Vanliga metoder för detektion av in vitro hVSMC-förkalkning inkluderar o-cresolphthalein-analysen, som mäter solubiliserad kalciumavsättning mot totalt protein och kräver celllys18. Dessutom används Alizarin Red färgning, som binder direkt till kalciumavlagringar på fasta celler eller vävnad19. För att studera hVSMC-förkalkning över tid med antingen o-kresolftalein eller Alizarin Red krävs satser av replikat per tidpunkt, vilket ökar efterfrågan på biologiskt material och i sin tur ökar risken för variabilitet.
I det här dokumentet beskriver vi metoden för tillämpning av en ny analys som använder hVSMC med en fluorescerande bildsond för att bestämma in vitro VC-progression samt fungera som en singulär förkalkningsanalys i slutstadiet. Vi har tidigare visat att denna analys är direkt jämförbar med metoderna o-cresolftalein och Alizarin Red och kan användas för att skilja mellan varierande odlingsförhållanden20. Förutom realtidsmätningar kan denna analys användas för att bestämma benägenheten hos serum- eller plasmaprover som en surrogatmarkör för klinisk VC-utveckling20. Detta kommer att hjälpa till vid tillämpningen av biologiska strategier för kardiovaskulär vetenskap och sjukdomsmodellering. En ytterligare tillämpning av analysen kan vara som ett translationellt BioHybrid-system för att bedöma VC-svårighetsgrad eller progression från blodbeståndsdelar såsom serum eller plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta manuskript beskriver vi en halvautomatisk metod för in vitro-förkalkningsbestämning. För denna metod bör tre kritiska steg i hVSMC-förkalkning optimeras. För det första är cellulär densitet avgörande för hVSMC-förkalkningsutveckling. Låga densiteter av hVSMC kommer att resultera i långsam eller ingen förkalkning och celldöd på grund av bristen på cell-till-cell-kontakt och den stress som induceras under förkalkningsförhållanden21. Höga celltätheter result…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt Marie Sklodowska-Curie-bidragsavtalet nr 722609 och 764474, NWO ZonMw (MKMD 40-42600-98-13007). Denna forskning stöddes av BioSPX. WJ-D fick finansiering från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tyska forskningsstiftelsen) TRR219-project ID 322900939 och project ID 403041552
Materials
| Calcium chloride, 93%, anhydrous | Thermo Fisher Scientific | 349615000 | |
| Costar 6-well Clear TC-treated well plates | Corning | 3516 | |
| Cytation 3 System | BioTek, Abcoude, The Netherlands | ||
| Fetal Bovine Serum | Merck | F7524-100ML | |
| Fetuin-A-Alexa Fluor-546 | Prepared in-house | ||
| Gen5 Software v3.10 | BioTek | ||
| Gibco Medium 199 | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300062 |
References
- Taylor, A. J., Bindeman, J., Feuerstein, I., Cao, F., Brazaitis, M., O’Malley, P. G. Coronary calcium independently predicts incident premature coronary heart disease over measured cardiovascular risk factors: mean three-year outcomes in the Prospective Army Coronary Calcium (PACC) project. Journal of the American College of Cardiology. 46 (5), 807-814 (2005).
- Arad, Y., Goodman, K. J., Roth, M., Newstein, D., Guerci, A. D. Coronary calcification, coronary disease risk factors, C-reactive protein, and atherosclerotic cardiovascular disease events the St. Francis Heart Study. Journal of the American College of Cardiology. 46 (1), 158-165 (2005).
- Detrano, R., et al. Coronary calcium as a predictor of coronary events in four racial or ethnic groups. New England Journal of Medicine. 358 (13), 1336-1345 (2008).
- Schurgers, L. J., Akbulut, A. C., Kaczor, D. M., Halder, M., Koenen, R. R., Kramann, R. Initiation and propagation of vascular calcification is regulated by a concert of platelet- and smooth muscle cell-derived extracellular vesicles. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 36 (2018).
- Jaminon, A., Reesink, K., Kroon, A., Schurgers, L. The role of vascular smooth muscle cells in arterial remodeling: focus on calcification-related processes. International Journal of Molecular Sciences. 20 (22), 5694 (2019).
- Mollet, N., et al. Coronary plaque burden in patients with stable and unstable coronary artery disease using multislice CT coronary angiography. La Radiologia Medica. 116 (8), 1174-1187 (2011).
- Galal, H., Rashid, T., Alghonaimy, W., Kamal, D. Detection of positively remodeled coronary artery lesions by multislice CT and its impact on cardiovascular future events. The Egyptian Heart Journal. 71 (1), 26 (2019).
- Benedek, T., Gyöngyösi, M., Benedek, I. Multislice computed tomographic coronary angiography for quantitative assessment of culprit lesions in acute coronary syndromes. The Canadian Journal of Cardiology. 29 (3), 364-371 (2013).
- Raggi, P. Cardiovascular calcification in end stage renal disease. Cardiovascular Disorders in Hemodialysis. 149, 272-278 (2005).
- Raggi, P. Coronary artery calcification predicts risk of CVD in patients with CKD. Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 324-326 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Yahagi, K., et al. Pathology of human coronary and carotid artery atherosclerosis and vascular calcification in diabetes mellitus. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (2), 191-204 (2017).
- Harper, E., Forde, H., Davenport, C., Rochfort, K. D., Smith, D., Cummins, P. M. Vascular calcification in type-2 diabetes and cardiovascular disease: Integrative roles for OPG, RANKL and TRAIL. Vascular Pharmacology. 82, 30-40 (2016).
- Lacolley, P., Regnault, V., Segers, P., Laurent, S. Vascular smooth muscle cells and arterial stiffening: relevance in development, aging, and disease. Physiological Reviews. 97 (4), 1555-1617 (2017).
- Pescatore, L. A., Gamarra, L. F., Liberman, M. Multifaceted mechanisms of vascular calcification in aging. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1307-1316 (2019).
- Herrmann, J., Babic, M., Tölle, M., vander Giet, M., Schuchardt, M. Research models for studying vascular calcification. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2204 (2020).
- Bowler, M. A., Merryman, W. D. In vitro models of aortic valve calcification: solidifying a system. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 24 (1), 1-10 (2015).
- Gitelman, H. J. An improved automated procedure for the determination of calcium in biological specimens. Analytical Biochemistry. 18 (3), 521-531 (1967).
- Furmanik, M., et al. Endoplasmic reticulum stress mediates vascular smooth muscle cell calcification via increased release of Grp78 (glucose-regulated protein, 78 kDa)-loaded extracellular vesicles. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 898-914 (2021).
- Jaminon, A. M. G., et al. Development of the BioHybrid assay: combining primary human vascular smooth muscle cells and blood to measure vascular calcification propensity. Cells. 10 (8), 2097 (2021).
- Reynolds, J. L., et al. Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and phosphate concentrations: a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 15 (11), 2857-2867 (2004).
- Wang, X. -. R., Zhang, J. -. J., Xu, X. -. X., Wu, Y. -. G. Prevalence of coronary artery calcification and its association with mortality, cardiovascular events in patients with chronic kidney disease: a systematic review and meta-analysis. Renal Failure. 41 (1), 244-256 (2019).
- Willems, B. A., et al. Ucma/GRP inhibits phosphate-induced vascular smooth muscle cell calcification via SMAD-dependent BMP signalling. Scientific Reports. 8 (1), 4961 (2018).
- Furmanik, M., et al. Reactive oxygen-forming Nox5 links vascular smooth muscle cell phenotypic switching and extracellular vesicle-mediated vascular calcification. Circulation Research. 127 (7), 911-927 (2020).
- Virtanen, P., Isotupa, K. Staining properties of alizarin red S for growing bone in vitro. Acta Anatomica. 108 (2), 202-207 (1980).
- Yang, H., Curinga, G., Giachelli, C. M. Elevated extracellular calcium levels induce smooth muscle cell matrix mineralization in vitro. Kidney International. 66 (6), 2293-2299 (2004).
- Pasch, A., et al. Nanoparticle-based test measures overall propensity for calcification in serum. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 23 (10), 1744-1752 (2012).
