in vivoでヒト免疫応答を操作するための異種移植片皮膚モデル
Summary
本プロトコルは、非肥満糖尿病(NOD)-scidインターロイキン-2ガンマ鎖受容体(NSG)マウスにヒト皮膚を移植する方法を記載している。移植のためのヒト皮膚の準備、移植のためのマウスの準備、分割厚さのヒト皮膚の移植、および移植後の回復手順の詳細な説明がレポートに含まれています。
Abstract
ヒトドナー皮膚を免疫不全マウス宿主に移植するヒト皮膚異種移植モデルは、皮膚免疫学におけるトランスレーショナル研究の重要な選択肢です。マウスとヒトの皮膚は、解剖学的構造および免疫細胞組成において実質的に異なる。したがって、従来のマウスモデルには、皮膚科学的研究と創薬には限界があります。ただし、異種移植を成功させるには技術的に困難であり、移植片と宿主の生存のために最適な標本とマウスの移植部位の準備が必要です。本プロトコルは、ヒトの皮膚をマウスに移植するための最適化された技術を提供し、下流の実験目的に必要な考慮事項について説明します。このレポートでは、ヒトドナー皮膚サンプルの適切な調製、手術セットアップの組み立て、マウスおよび手術部位の準備、皮膚移植、および術後のモニタリングについて説明します。これらの方法を順守することで、術後6週間以上異種移植片を維持することができます。以下に概説する技術は、工学的制御、滅菌技術、および術前および術後のコンディショニングの開発により、最大の移植効率を可能にします。異種移植片モデルの適切な性能により、ヒト皮膚の実験的特性評価および in vivo化合物の前臨床試験のための長寿命のヒト皮膚移植サンプルが得られます。
Introduction
マウスモデルは、実験的な再現性と遺伝子操作の能力のために、人間の生物学と病気についての推論を行うために頻繁に使用されます。しかし、マウス生理学はヒトの臓器系、特に皮膚を完全に再現するものではないため、創薬における前臨床モデルとしての利用には限界があります1。マウスとヒトの皮膚の解剖学的違いには、上皮の厚さと構造の違い、マウスエクリン汗腺の欠如、およびヘアサイクリングの変化が含まれます2。さらに、免疫系の先天的アームと適応アームの両方が2つの種の間で分岐しています3。マウスの皮膚は、樹状表皮T細胞(DETC)のユニークな免疫集団を含み、真皮γδT細胞の存在量が高く、ヒト組織と比較して免疫細胞サブセットの局在が異なります4。したがって、ヒトの皮膚生物学および炎症に関する実験的知見は、ヒト組織による検証の恩恵を受ける。 in vitro およびオルガノイド培養システムは、ヒト組織の研究に広く利用されているツールですが、これらのシステムは、免疫再構成の欠如または不完全、および末梢血管系との関連性の欠如によって制限されています5。ヒト化異種移植皮膚移植モデルは、 in vivoでのヒト組織における免疫経路および非免疫経路の治療的または生物学的操作を可能にすることを目的としています。
ヒト皮膚異種移植片モデルは、皮膚生理学と薬理学の研究、免疫拒絶反応と反応の分析、ヒト皮膚がんのメカニズムの解剖、皮膚疾患と創傷治癒の理解に利用されています6。皮膚研究の複数の分野に適用できますが、異種移植片モデルは in vitro 研究よりもスループットが低く、マウスモデルで採用されている遺伝子操作の容易さに欠けています。このモデル内の時点は数週間から数か月の範囲であり、移植を成功させるには、これらの手術を実行するための適切な施設と機器が必要です。しかしながら、異種移植片モデルは実験に生物学的および生理学的文脈を提供するが、組織外植片などのオルガノイド培養系は、しばしば特定の時間間隔で外因性シグナルなどの無数の可動部分を複製することを必要とする7。したがって、このモデルは、 in vitro およびマウスモデル内で観察された所見をさらに検証するため、または生物学的に実現不可能な研究のために最もよく利用されます。異種移植片モデルの適切な使用は、 in vivoで無傷のヒト組織を研究し、操作するユニークな機会を提供します。
異種移植片皮膚移植モデルの最適化は、移植片の完全性を長期にわたって維持するために数十年の研究に依存してきました。このプロセスに重要なのは、BおよびT適応免疫細胞、機能的なNK細胞を欠き、マクロファージと樹状細胞に欠損している非肥満糖尿病(NOD)-scidインターロイキン-2ガンマ鎖受容体(NSG)マウスを利用することです8。これらのNSG宿主の免疫不全の性質は、ヒト造血細胞、患者由来の癌、および皮膚の移植を可能にする8,9,10。この免疫抑制宿主環境にもかかわらず、抗GR1投与によるマウス好中球免疫応答のさらなる抑制が移植片の成功に必要である10。無傷の組織を移植する際の主な障害は、感染、拒絶反応、および移植片への血流の再確立の難しさであり、皮膚および表皮の完全性の喪失につながることがあります11。抗FR1の投与および適切な移植深さの使用を含む技術は、移植片生存を改善する10。綿密な最適化により、NSGマウスにヒト異種移植片皮膚移植を90%〜100%の範囲の高効率と生存率で実施することが可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウス異種移植皮膚移植モデルは、 in vivo 設定でヒト皮膚免疫応答を機械的に解剖するための重要な技術です14。皮膚異種移植の成功は、マウスと皮膚標本とマウスの適切な準備と無菌げっ歯類手術方法の順守に依存しています15。皮膚サンプルを培地(滅菌生理食塩水など)に低温で迅速に冷却して適切に保管することは、移植前の継続的な組織の健?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、TRex Bioからのスポンサー付き研究契約とNIHからの助成金(1R01AR075864-01A1)によって資金提供されました。JMMは、Cancer Research Society(助成金26005)の支援を受けています。我々は、助成金NIH P30 DK063720、S10 1S10OD021822-01、およびS10 1S10OD018040-01によって部分的にサポートされているParnassusフローサイトメトリーコアを認めます。
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- . The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021)
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in rodent aseptic surgery. Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C. 3D skin models in domestic animals. Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
