מודל Xenograft לעור למניפולציה של תגובות חיסוניות אנושיות in vivo
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתיל עור אנושי בעכברים סוכרתיים שאינם שמנים (NOD)-scid interleukin-2 קולטן שרשרת גמא (NSG). בדו”ח נכללים תיאור מפורט של הכנת עור אדם להשתלה, הכנת עכברים להשתלה, השתלת עור אדם בעובי מפוצל והליך התאוששות לאחר ההשתלה.
Abstract
מודל קסנוגרפט העור האנושי, שבו מושתל עור תורם אנושי בפונדקאי עכבר חסר חיסון, הוא אופציה חשובה למחקר תרגומי באימונולוגיה של העור. מורין ועור האדם נבדלים זה מזה באופן מהותי באנטומיה ובהרכב תאי מערכת החיסון. לכן, למודלים מסורתיים של עכברים יש מגבלות למחקר דרמטולוגי ולגילוי תרופות. עם זאת, קסנוטרנספלנטים מוצלחים הם מאתגרים מבחינה טכנית ודורשים הכנה אופטימלית של אתר הדגימה והשתלת העכבר להישרדות השתל והמארח. הפרוטוקול הנוכחי מספק טכניקה אופטימלית להשתלת עור אנושי בעכברים ודן בשיקולים הכרחיים למטרות ניסוי במורד הזרם. דו”ח זה מתאר הכנה מתאימה של דגימת עור של תורם אנושי, הרכבה של מערך כירורגי, הכנת עכברים ואתרים כירורגיים, השתלת עור וניטור לאחר ניתוח. הקפדה על שיטות אלה מאפשרת שמירה על קסנוגרפטים במשך למעלה מ-6 שבועות לאחר הניתוח. הטכניקות המפורטות להלן מאפשרות יעילות השתלה מקסימלית בשל פיתוח בקרות הנדסיות, טכניקה סטרילית והתניה לפני ואחרי ניתוח. ביצועים מתאימים של מודל xenograft מביאים לדגימות השתלת עור אנושיות ארוכות טווח לאפיון ניסיוני של עור אנושי ובדיקות פרה-קליניות של תרכובות in vivo.
Introduction
מודלים של עכברים משמשים לעתים קרובות כדי להסיק מסקנות לגבי ביולוגיה ומחלות אנושיות, בין היתר בשל יכולת השחזור הניסיונית שלהם ויכולת המניפולציה הגנטית שלהם. עם זאת, הפיזיולוגיה של העכבר אינה משחזרת לחלוטין את מערכות האיברים האנושיים, במיוחד את העור, ולכן יש לה מגבלות לשימוש כמודל פרה-קליני בפיתוח תרופות1. הבדלים אנטומיים בין עור העכבר לעור האדם כוללים הבדלים בעובי האפיתל ובארכיטקטורה, מחסור בבלוטות זיעה מורין אקרין ושינויים במחזור השיער2. יתר על כן, הן הזרועות המולדות והן הזרועות הנרכשות של מערכת החיסון שונות בין שני המינים3. עור העכבר מכיל אוכלוסייה חיסונית ייחודית של תאי T אפידרמליים דנדריטיים (DETCs), יש לו שפע גבוה יותר של תאי γδ T עוריים, והוא משתנה בלוקליזציה של תת-קבוצה של תאי מערכת החיסון בהשוואה לרקמות אנושיות4. לכן, ממצאים ניסיוניים לגבי ביולוגיה ודלקת של עור האדם נהנים מאימות עם רקמות אנושיות. בעוד שמערכות תרבית חוץ גופית ואורגנואידית נמצאות בשימוש נרחב בכלים לחקר רקמות אנושיות, מערכות אלה מוגבלות על ידי שחזור חיסוני נעדר או לא שלם וחוסר חיבור לכלי הדם ההיקפיים5. מודל השתלת העור האנושי של קסנוגרפט נועד לאפשר מניפולציה טיפולית או ביולוגית של מסלולים חיסוניים ולא חיסוניים ברקמות אנושיות in vivo.
מודל קסנוגרפט העור האנושי שימש לחקר פיזיולוגיה ופרמקולוגיה של העור, ניתוח דחייה ותגובות של מערכת החיסון, ניתוח מנגנוני סרטן עור אנושיים והבנת מחלות עור וריפוי פצעים6. למרות שהוא ישים לתחומים רבים של מחקר עור, למודל xenograft יש תפוקה נמוכה יותר מאשר למחקרים במבחנה והוא חסר את הקלות של מניפולציה גנטית המשמשת במודלים של עכברים. נקודות הזמן במודל זה עשויות לנוע בין שבועות לחודשים, והשתלה מוצלחת דורשת מתקנים וציוד מתאימים לביצוע ניתוחים אלה. עם זאת, מודל xenograft מספק הקשר ביולוגי ופיזיולוגי לניסויים, בעוד שמערכות תרבית אורגנואידיות, כגון explants רקמות, דורשות לעתים קרובות שכפול של מספר עצום של חלקים נעים, כגון אותות אקסוגניים, במרווחי זמן ספציפיים7. לכן, מודל זה מנוצל בצורה הטובה ביותר כדי לאמת עוד יותר ממצאים שנצפו במבחנה ובתוך מודלים של עכברים, או לעבודה שאינה אפשרית ביולוגית אחרת. שימוש נכון במודל xenograft מספק הזדמנות ייחודית לחקור ולתפעל רקמות אנושיות שלמות in vivo.
אופטימיזציה של מודל השתלת העור xenograft הסתמכה על עשרות שנים של מחקר כדי לשמור על שלמות השתל לאורך זמן. קריטי לתהליך זה הוא שימוש בעכבר קולטן שרשרת הגמא (NSG) של סוכרתיים שאינם שמנים (NOD)-scid interleukin-2, אשר חסר תאי חיסון מסתגלים מסוג B ו-T, תאי NK מתפקדים, ויש לו ליקויים במקרופאגים ובתאים דנדריטיים8. האופי החיסוני של מארחי NSG אלה מאפשר השתלה של תאים המטופויאטיים אנושיים, סרטן שמקורו בחולה ועור 8,9,10. למרות הסביבה המארחת המדכאת את מערכת החיסון, דיכוי נוסף של תגובות חיסוניות נויטרופיליות של עכברים על-ידי מתן anti-GR1 נחוץ להצלחת השתל10. המחסומים העיקריים בהשתלת רקמה שלמה הם זיהום, דחייה וקושי לבסס מחדש את זרימת הדם לשתל, מה שמוביל לעיתים לאובדן שלמות העור והאפידרמיס11. טכניקות הכוללות מתן אנטי-FR1 ושימוש בעומק השתל המתאים משפרות את הישרדות השתל10. אופטימיזציה קפדנית מאפשרת לבצע השתלות עור של קסנוגרפט אנושי בעכברי NSG עם יעילות גבוהה ושיעורי הישרדות, הנעים בין 90%-100%.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודל השתלת העור של xenograft של העכבר הוא טכניקה מרכזית לניתוח מכניסטי של תגובות חיסוניות של עור אנושי בסביבה in vivo 14. השתלות מוצלחות של קסנוגרפט עור מסתמכות על הכנה מתאימה של עכברים ודגימות עור ועכברים והיצמדות לשיטות ניתוח מכרסמים אספטיים15. קירור מהיר ואחסון נכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה בחלקה על ידי הסכמי מחקר ממומנים של TRex Bio ומענקים מה-NIH (1R01AR075864-01A1). JMM נתמך על ידי האגודה לחקר הסרטן (מענק 26005). אנו מכירים בליבת הציטומטריה של זרימת פרנסוס הנתמכת בחלקה על ידי מענקים NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01, ו- S10 1S10OD018040-01.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- . The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021)
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in rodent aseptic surgery. Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C. 3D skin models in domestic animals. Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
