Ксенотрансплантатная модель кожи для манипулирования иммунными реакциями человека In Vivo
Summary
Настоящий протокол описывает, как трансплантировать кожу человека мышам, не страдающим ожирением диабетического (NOD)-scid интерлейкина-2 рецептора гамма-цепи (NSG). В отчет включено подробное описание подготовки кожи человека к пересадке, подготовки мышей к пересадке, трансплантации расщепленной кожи человека и процедуры посттрансплантационного восстановления.
Abstract
Модель ксенотрансплантата кожи человека, в которой донорская кожа человека пересаживается иммунодефицитному мышиному хозяину, является важным вариантом для трансляционных исследований в иммунологии кожи. Мышиная и человеческая кожа существенно различаются по анатомии и составу иммунных клеток. Поэтому традиционные мышиные модели имеют ограничения для дерматологических исследований и открытия лекарств. Тем не менее, успешные ксенотрансплантаты являются технически сложными и требуют оптимальной подготовки образца и участка трансплантата мыши для выживания трансплантата и хозяина. Настоящий протокол предоставляет оптимизированную технику для трансплантации кожи человека мышам и обсуждает необходимые соображения для последующих экспериментальных целей. В этом отчете описывается надлежащая подготовка образца кожи донора человека, сборка хирургической установки, подготовка мыши и хирургического участка, трансплантация кожи и послеоперационный мониторинг. Соблюдение этих методов позволяет поддерживать ксенотрансплантаты в течение более 6 недель после операции. Методы, описанные ниже, обеспечивают максимальную эффективность прививки благодаря разработке инженерных средств контроля, стерильной техники и пред- и послеоперационного кондиционирования. Соответствующая производительность модели ксенотрансплантата приводит к получению образцов долгоживущих трансплантатов кожи человека для экспериментальной характеристики кожи человека и доклинического тестирования соединений in vivo.
Introduction
Мышиные модели часто используются для того, чтобы делать выводы о биологии и болезнях человека, отчасти из-за их экспериментальной воспроизводимости и способности к генетическим манипуляциям. Однако физиология мышей не полностью повторяет системы органов человека, особенно кожи, и поэтому имеет ограничения для использования в качестве доклинической модели при разработке лекарств1. Анатомические различия между кожей мыши и человека включают различия в толщине и архитектуре эпителия, отсутствие мышиных эккриновых потовых желез и вариации в круговороте волос2. Кроме того, как врожденные, так и адаптивные ветви иммунной системы расходятся между двумя видами3. Кожа мыши содержит уникальную иммунную популяцию дендритных эпидермальных Т-клеток (DETC), имеет более высокое обилие дермальных γδ-Т-клеток и варьируется по локализации подмножества иммунных клеток по сравнению с тканями человека4. Таким образом, экспериментальные результаты, касающиеся биологии кожи человека и воспаления, выигрывают от проверки с человеческими тканями. В то время как системы культуры in vitro и органоидные культуры широко используются для изучения тканей человека, эти системы ограничены отсутствующим или неполным восстановлением иммунитета и отсутствием связи с периферической сосудистой системой5. Гуманизированная модель трансплантации кожи ксенотрансплантата направлена на то, чтобы позволить терапевтические или биологические манипуляции с иммунными и неиммунными путями в тканях человека in vivo.
Модель ксенотрансплантата кожи человека была использована для изучения физиологии и фармакологии кожи, анализа иммунного отторжения и реакций, анализа механизмов рака кожи человека и понимания кожных заболеваний и заживления ран6. Хотя модель ксенотрансплантата применима к нескольким областям исследований кожи, она имеет более низкую пропускную способность, чем исследования in vitro , и ей не хватает простоты генетических манипуляций, используемых в мышиных моделях. Временные точки в этой модели могут варьироваться от недель до месяцев, и для успешной трансплантации требуются соответствующие средства и оборудование для выполнения этих операций. Тем не менее, модель ксенотрансплантата обеспечивает биологический и физиологический контекст для экспериментов, в то время как системы органоидных культур, такие как тканевые экспланты, часто требуют воспроизведения множества движущихся частей, таких как экзогенные сигналы, через определенные промежутки времени7. Поэтому эту модель лучше всего использовать для дальнейшей проверки результатов, наблюдаемых in vitro и в мышиных моделях, или для работы, которая в противном случае биологически невозможна. Надлежащее использование модели ксенотрансплантата дает уникальную возможность изучать и манипулировать неповрежденными тканями человека in vivo.
Оптимизация модели пересадки кожи ксенотрансплантата опиралась на десятилетия исследований для сохранения целостности трансплантата с течением времени. Критически важным для этого процесса является использование мыши без ожирения диабетического (NOD)-scid интерлейкина-2 рецептора гамма-цепи (NSG), у которого отсутствуют B и T-адаптивные иммунные клетки, функциональные NK-клетки и недостатки в макрофагах и дендритных клетках8. Иммунодефицитная природа этих хозяев NSG позволяет трансплантировать человеческие кроветворные клетки, рак пациента и кожу 8,9,10. Несмотря на эту иммуносупрессивную среду хозяина, дополнительное подавление нейтрофильных иммунных реакций мышей путем введения анти-GR1 необходимо для успеха трансплантата10. Основными препятствиями при пересадке неповрежденной ткани являются инфекция, отторжение и трудности с восстановлением притока крови к трансплантату, иногда приводящие к потере кожной и эпидермальной целостности11. Методы, включая введение анти-FR1 и использование соответствующей глубины трансплантата, улучшают выживаемость трансплантата10. Тщательная оптимизация позволяет выполнять пересадку кожи ксенотрансплантата человека на мышах NSG с высокой эффективностью и выживаемостью, в пределах 90%-100%.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модель пересадки кожи ксенотрансплантата мыши является ключевым методом механистического препарирования иммунных реакций кожи человека в условиях in vivo 14. Успешная трансплантация ксенотрансплантата кожи зависит от соответствующей подготовки мышей и образцов кожи ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично финансировалась за счет спонсируемых исследовательских соглашений от TRex Bio и грантов от NIH (1R01AR075864-01A1). JMM поддерживается Обществом исследований рака (грант 26005). Мы признаем, что парнасское проточное цитометрическое ядро частично поддерживается грантами NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 и S10 1S10OD018040-01.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- . The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021)
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in rodent aseptic surgery. Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C. 3D skin models in domestic animals. Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
