유방암의 영상 유도 예방 치료를 위해 쥐 유방 유관 나무에 화학적 절제 용액을 전달하는 절차가 설명됩니다. 유방 상피 세포는 유두 개구부에 직접 캐뉼레이션과 70 % 에탄올 기반 절제 용액의 덕트 내 주입을 통해 최소한의 부수적 인 조직 손상으로 표적화 될 수 있습니다.
유방암 예방을위한 1 차 중재는 여전히 제한되어 있습니다. 유방암 발병 위험이 높은 여성의 경우 가장 효과적인 개입은 예방 적 유방 절제술입니다. 이것은 유방암을 유발할 수있는 유방 상피 세포가 주변 조직과 함께 완전히 제거되는 과감한 수술 절차입니다. 이 프로토콜의 목표는 유방암 예방을위한 새로운 1 차 개입이 될 수있는 최소 침습적 관내 절차의 타당성을 입증하는 것입니다. 이 국소 절차는 유방 상피 세포가 악성이되기 전에 우선적으로 제거합니다. 유방암의 설치류 모델에서 이러한 상피 세포에 직접 용액을 전달하는 덕트 내 방법은 미시간 주립 대학 및 다른 곳에서 개발되었습니다. 쥐 유선은 인간의 유방에 비해 더 단순하고 선형적인 구조를 가진 단일 덕트 나무로 구성됩니다. 그러나 화학적으로 유도 된 유방암 쥐 모델은 마우스 모델에서 인간으로의 새로운 예방 개입 및 확장 성에 대한 개념 증명 연구에 유용한 도구를 제공합니다. 여기서, X선 조영제로서 산화탄탈륨 나노입자와 겔화제로서 에틸셀룰로오스를 함유하는 에탄올계 절제 용액을 래트 유관 트리로 덕트 내 전달하는 절차가 설명된다. 관내 주사에 의한 수성 시약 (예를 들어, 세포독성 화합물, siRNAs, AdCres)의 전달은 마우스 및 래트 모델에서 이전에 기술되었다. 이 프로토콜 설명은 절제 용액 전달, 절제 용액의 국소 및 전신 부작용을 최소화하기 위한 제형 고려, 덕트 트리 충전의 생체 내 평가를 위한 X선 이미징과 고유하게 관련된 방법론적 변화 및 단계를 강조합니다. 형광투시 및 micro-CT 기술을 사용하면 탄탈륨 함유 조영제와의 호환성 덕분에 절제 용액 전달의 성공 여부와 덕트 트리 충전 정도를 결정할 수 있습니다.
미국 여성의 경우1, 유방암(BC)은 계속해서 가장 많이 진단된 암 유형이며 폐암을 제외한 다른 암 유형보다 더 많은 사망을 초래합니다. 2022년 예측에 따르면 51,400명의 여성이 제자리 암종 진단을 받고 287,850명의 여성이 침윤성 암종으로 진단되며 43,600명의 여성이 BC1로 사망할 것으로 추정됩니다. BC 주와 관련된 유병률과 사망률에도 불구하고, 1 차 예방이 연방 기관에 의해 우선 순위가 지정되지 않기 때문에 새로운 개입에 대한 1 차 예방 및 번역 연구에 사용할 수있는 옵션이 거의 없습니다2. 예방 적 유방 절제술은 1 차 예방을위한 가장 효과적인 개입입니다. 그러나 이 절차는 삶을 변화시키는 결과를 초래하는 대수술이기 때문에 고위험군에게만 권장됩니다3. 이 수술은 발암이 발생하는 유방 상피 세포와 정상적인 주변 조직을 완전히 제거하는 것을 포함합니다. 개인은 종종 신체적, 심리적, 사회적 스트레스의 부정적인 영향으로 인해이 절차를 1 차 개입의 첫 번째 옵션으로 사용하지 못하게합니다. 이러한 이유로 일부 고위험군조차도이 절차를 거치지 않고 대신 조심스러운 대기 또는 유사한 감시 전략을 선택합니다3. 이전 간행물에서, 70% 에탄올(EtOH)을 마우스 모델의 덕트 트리로 직접 전달하는 것은 인접한 정상 조직에 대한 제한된 손상으로 유방 상피 세포를 화학적으로 절제하고 유방종양 형성을 예방하는 데 효과적이었습니다4. EtOH는 일부 암의 국소 치료를위한 절제제 또는 동정맥 부종 및 기형의 국소 치료를위한 경화제로 여러 임상 응용 분야에서 사용됩니다 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . EtOH의 낮은 독성 및 안전성 프로파일은 일부 절차에서 세션 당 최대 50mL의 95 % EtOH를 투여 할 수 있기 때문에 잘 확립되어 있습니다 5,10.
BC가 발생하는 유방 상피 세포의 완전한 제거는 예방 적 유방 절제술과 절제 용액의 국소 전달의 가장 중요한 구성 요소입니다. 따라서 절제 용액이 모든 유방 상피 세포와 직접 접촉했음을 보장하기 위해 완전한 덕트 트리 충전의 확인이 필요합니다. 덕트 트리 내에서 솔루션을 제공하고 이미지 유도 형광 투시 또는 덕트 조영술에 의한 시각화는 이미 존재하는 임상 절차를 통해 가능합니다15,16,17. 따라서 임상 시험에서이 절차를 쉽게 구현하고 평가할 수 있습니다. 1차 예방을 위한 새로운 중재로서 관내(ID) 절제의 효능 및 번역 타당성을 확립하는 핵심 단계는 관내트리 아키텍처의 크기와 복잡성이 증가하는 동물 모델에서 이 X선 시각화 접근법의 타당성을 입증하는 것입니다4,18,19. 이 절제 절차를 마우스20에서 래트 모델로 확장하는 프로토콜이 여기에 설명되어 있습니다. 마우스와 쥐 덕트 나무는 유사한 선형 구조와 분기 패턴을 가지고 있지만 쥐 덕트 나무는 비례 적으로 더 크고 훨씬 더 조밀 한 간질로 둘러싸여 있습니다. 우리는 실험실에서 조영제가 포함 된 절제 용액으로 일련의 주간 세션에 걸쳐 쥐의 모든 유선을 성공적으로 주입하는 방법을 구현했습니다. 동물이 EtOH의 부작용을 최소화하도록 하기 위해 세션 간격이 필요합니다(그림 1 및 그림 2). 이 절차는 33G 바늘로 이소 플루 란 마취 된 쥐의 젖꼭지 개구부에 절제 용액을 직접 주입하는 것을 포함합니다. 절차의 몇 가지 주요 개선 사항에는 연장된 항염증 치료의 사용, 제안된21개보다 더 많은 양의 덕트 트리당 더 많은 양의 주입, 액체 및 가스용 기밀 주사기가 포함됩니다. ID 주사 전 48 시간부터 1 주일까지 5mg / kg의 카프로 펜 (NSAID)으로 치료하는 기간은 클리닉에서 정맥 기형의 경화 치료에 사용되는 항 염증 프로토콜과 유사합니다. 치료는 전신 마취하에 환자에게 수행 한 후 NSAID와 같은 항염증제를 2 일간 복용합니다. 항염증 치료는 국소 염증 및 잠재적인 통증을 줄이기 위해 며칠 더 연장될 수 있습니다13. 마우스20에서와 같이, 5 % 슈 크로스 용액의 복강 내 주사는 래트에서 알코올 중독의 단기 효과를 완화시킨다. 쥐는 이 자당 용액과 함께 투여할 때 단일 세션에서 최대 1mL의 70% EtOH(최대 4개의 덕트, 혈액 내 0.2g/dL의 EtOH 함량)를 주사할 수 있습니다. 동물은 ID 주사 후 4 시간 이내에 완전히 회복됩니다. 우리는 4 개 이상의 땀샘 및 / 또는 더 높은 EtOH 농도를 주사 할 때 충분한 회복 시간을 허용하기 위해 순차적 세션을 수행합니다. 여성의 알코올 중독은 16 개의 주 덕트16,17 및 덕트22,23 당 2 mL를 가정하고 70 % EtOH로 양쪽 유방의 모든 덕트 나무의 ID 주사로 훨씬 적습니다 혈액 내 EtOH 함량이 0.1g/ dL 미만이며 경미한 손상을 유발할 수 있습니다.
X선 이미징을 통해 각 개별 샘에서 관내 전달이 얼마나 성공적인지, 전체 관나무가 채워졌는지 여부를 결정할 수 있습니다(그림 1, 그림 2, 그림 3). DICOM 파일 데이터의 마이크로 CT 스캔 및/또는 3D 재구성을 준비하기 위한 실시간 형광투시 이미징을 사용하여 덕트 트리로의 용액 전달 범위와 기질로의 누출을 평가할 수 있습니다. 형광 투시법을 사용하면 동물에게 부과되는 전체 방사선 량을 제한하는 데 도움이 될 수 있습니다. 형광 투시 기술은 이 절제 치료의 이미지 유도를 위한 의도된 임상 적용에 더 가깝습니다. FDA 승인 요오드 함유 Isovue와 산화 탄탈륨 (TaOx) 나노 입자의 비교는 절제 용액 4,19의 유용성을 더욱 정제하기 위해 수행되었습니다. TaOx는 마우스 4,19에서 덕트 나무의 초기 충전을 시각화하기 위해 Isovue보다 우수한 마이크로 CT 조영제임이 밝혀졌습니다. 여기서 우리는 TaOx가 쥐 덕트 나무의 초기 충전을 시각화하는 데 적합한 조영제임을 보여줍니다 (그림 2 및 그림 3). 중개 연구 및 임상 실습 응용 분야 모두에서 겔화제 에틸 셀룰로오스 (EC)를 EtOH 용액에 첨가하여 의도 된 표적 영역 13,14,24,25,26,27,28,29로부터의 확산을 최소화했습니다. 연구에 따르면 EtOH 함유 절제 용액에 최대 1.5% EC를 첨가하면TaOx 기반 이미징과 호환되는 것으로 나타났습니다(그림 3). 이러한 절제 용액에 대한 추가 개선은 이 이미지 유도 절차를 클리닉으로 즉시 번역하는 데 도움이 될 수 있습니다.
여기에 나타낸 바와 같이, 70% EtOH의 ID 전달은 마우스4에서 주변 기질 및 혈관구조에 대한 제한된 부수적 손상으로 유방 상피 세포를 우선적으로 제거합니다. 유관 나무의 국소 절제는 마우스 모델4에서 종양 형성을 예방하는 데 효과적입니다. 여기에서 우리는 이 절제 절차가 쥐까지 확장될 수 있음을 보여줍니다.
이것은 고위험군의 유방암 예방을위한 예방 적 유방 절제술에 대한 대체 개입으로이 절제 절차를 번역하는 경로의 다음 단계입니다. 절제 용액에 X 선 조영제로서TaOx 나노 입자를 첨가하면 절차가 덕트 트리를 완전히 채우는 데 성공했는지 여부를 결정할 수 있으므로 종양 형성을 예방하는 데 용액의 효과를 평가할 수 있습니다. 형광 투시법을 사용하여 주입된 유선을 시각화하면 이 ID 절차를 안내하기 위해 클리닉에서 수행될 가능성이 있는 작업을 반영합니다. 용액이 덕트 트리를 얼마나 채우고 주입을 중단해야하는지에 대한 이미지 안내는 각 덕트 트리의 최대 충전을 보장하기위한 임상 구현의 핵심 측면이 될 것입니다. 문제 해결 및 유용한 팁은 표 1에 나열되어 있습니다. 이 절제 절차의 효과는 주입 된 용액이 세포 사멸 속도를 최대화하기 위해 모든 상피 세포와 직접 접촉해야합니다. 하나 이상의 나무 내의 여분의 상피 세포는 결국 BC 발달의 원천이 될 수 있습니다. 다른 그룹은 바이러스 입자 (예를 들어, Cre/LoxP 및/또는 Cas9/CRISPR 시스템의 성분), 호르몬 및 호르몬 길항제 (예를 들어, 프로락틴, 풀베스트란트), 화학요법제 (예를 들어, 시스플라틴), siRNA 및/또는 항체 또는 마우스의 다른 표적화제의 ID 전달을 보고하였다 4,19,21,35,36,37,38,39,40, 41,42,43,44,45, 래트 21,33,46,47,48 및/또는 토끼 18,49,50,51,52,53 . 화학 요법의 국소 전달을 위해 인간 유방 당 최대 8 개의 덕트 트리의 성공적인 캐뉼레이션이 독립적 인 임상 연구47,54,55에서보고되었습니다. 종양 예방을 목표로 하거나 국소 치료를 목표로 하는 이러한 다른 용액의 주입을 위한 이미지 안내는 유사하게 그 효과를 극대화할 것입니다.
마우스에서 쥐관 나무까지이 절차의 확장 성과 개선이 여기에서 입증됩니다. 쥐 4,19 및 쥐 (미공개 데이터) 유관 나무의TaOx 나노 입자는 FDA 승인 요오드 함유 X 선 조영제를 능가하는 고해상도 이미징을 제공합니다. 유사하게, 우리는 마우스(40,41) 또는 다른 동물 모델(18)에서TaOx에 필적하는 해상도를 제공할 수 있는 다른 덕트 트리 이미징 접근법을 알지 못한다. 임상 번역과 관련된 것은 이 중간 크기의 쥐 모델에서 EC의 겔화 효과가 부수적 조직 손상을 최소화하기 위한 제형 정제를 가능하게 한다는 사실입니다. BC를 예방하는 능력에 대해 이 절제 ID 절차를 계속 평가함에 따라, 화학적으로 유도된 BC 및 기타 쥐 모델에서 ID 전달 후 영상에 의해 제공된 추가 정보를 통해 BC가 발달하는 땀샘을 보다 정확하게 결정할 수 있을 것입니다. 이 데이터는이 절차의 안전성을 결정하고 부분 또는 실패한 치료 된 덕트 나무가 고위험 여성에서 BC 주에 걸릴 가능성이 더 높은지에 대한 우려 사항이나 단점을 정확히 지적합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 LFS에 대한 국립 암 연구소 R21 CA226579 및 R01 CA258314 보조금과 EMS에 대한 국립 생물 의학 이미징 및 생명 공학 연구소 R01 EB029418 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 우리는 이미징 시스템과 기술 전문 지식을 사용하기 위해 MSU 정량적 (IQ) 건강 과학 및 엔지니어링 이미징 코어 시설에 감사드립니다. 동물 복지 지침을 준수하기 위해 비디오의 내용과 수치를 검토해 주신 Danielle Ferguson 박사에게 감사드립니다.
AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
Ethyl cellulose | Acros Organics | 9004-57-3 | For intraductal injection |
Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL | Hamilton | 81220 | For intraductal injection |
Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4) | Hamilton | 7747-01 | For intraductal injection |
Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |