एक अनुकूलित छिड़काव बायोरिएक्टर में पोर्सिन संवहनी फ्लैप की खरीद और छिड़काव-डीसेल्युलराइजेशन
Summary
प्रोटोकॉल एक अनुकूलित छिड़काव बायोरिएक्टर में फ्लैप वास्कुलचर के माध्यम से सोडियम डोडेसिल सल्फेट डिटर्जेंट के छिड़काव द्वारा संवहनी पोर्सिन फ्लैप की सर्जिकल खरीद और बाद में डीसेल्युलराइजेशन का वर्णन करता है।
Abstract
बड़ी मात्रा में नरम ऊतक दोष कार्यात्मक घाटे का कारण बनते हैं और रोगी के जीवन की गुणवत्ता को बहुत प्रभावित कर सकते हैं। यद्यपि सर्जिकल पुनर्निर्माण ऑटोलॉगस फ्री फ्लैप ट्रांसफर या संवहनी समग्र एलोट्रांसप्लांटेशन (वीसीए) का उपयोग करके किया जा सकता है, ऐसे तरीकों के नुकसान भी हैं। दाता साइट रुग्णता और ऊतक उपलब्धता जैसे मुद्दे ऑटोलॉगस मुक्त फ्लैप हस्तांतरण को सीमित करते हैं, जबकि इम्यूनोसप्रेशन वीसीए की एक महत्वपूर्ण सीमा है। पुनर्कोशिकीयकरण विधियों का उपयोग करके पुनर्निर्माण सर्जरी में इंजीनियर ऊतक एक संभावित समाधान का प्रतिनिधित्व करते हैं। डीसेल्यूलराइज्ड ऊतक उन तरीकों का उपयोग करके उत्पन्न होते हैं जो अंतर्निहित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) माइक्रोआर्किटेक्चर को संरक्षित करते हुए देशी सेलुलर सामग्री को हटा देते हैं। इन अकोशिकीय मचानों को बाद में प्राप्तकर्ता-विशिष्ट कोशिकाओं के साथ पुन: कोशिकीय किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल सुअर मॉडल में एककोशिकीय मचानों को प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली खरीद और डीसेल्युलराइजेशन विधियों का विवरण देता है। इसके अलावा, यह छिड़काव बायोरिएक्टर डिजाइन और सेटअप का विवरण भी प्रदान करता है। फ्लैप में पोर्सिन ओमेंटम, टेंसर प्रावरणी लता और रेडियल अग्रभाग शामिल हैं। डीसेल्यूलराइजेशन कम सांद्रता सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) डिटर्जेंट के पूर्व विवो छिड़काव के माध्यम से किया जाता है, जिसके बाद एक अनुकूलित छिड़काव बायोरिएक्टर में डीएनएस एंजाइम उपचार और पेरासिटिक एसिड नसबंदी होती है।
सफल ऊतक विकोशिकीयकरण को मैक्रोस्कोपिक रूप से फ्लैप की सफेद-अपारदर्शी उपस्थिति की विशेषता है। एककोशिकीय फ्लैप हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन पर नाभिक की अनुपस्थिति और डीएनए सामग्री में महत्वपूर्ण कमी दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग संरक्षित ईसीएम और संवहनी माइक्रोआर्किटेक्चर के साथ डीसेल्यूलराइज्ड नरम ऊतक मचानों को उत्पन्न करने के लिए कुशलतापूर्वक किया जा सकता है। इस तरह के मचानों का उपयोग बाद के पुनर्कोशिकीय अध्ययनों में किया जा सकता है और पुनर्निर्माण सर्जरी में नैदानिक अनुवाद की क्षमता है।
Introduction
दर्दनाक चोट और ट्यूमर हटाने से बड़े और जटिल नरम ऊतक दोष हो सकते हैं। ये दोष रोगी के जीवन की गुणवत्ता को खराब कर सकते हैं, कार्य की हानि का कारण बन सकते हैं, और इसके परिणामस्वरूप स्थायी विकलांगता हो सकती है। जबकि ऑटोलॉगस ऊतक फ्लैप ट्रांसफर जैसी तकनीकों का आमतौर पर अभ्यास किया गया है, फ्लैप उपलब्धता और दाता साइट रुग्णता के साथ मुद्दे प्रमुख सीमाएं 1,2,3 हैं। संवहनी समग्र एलोट्रांसप्लांटेशन (वीसीए) एक आशाजनक विकल्प है जो प्राप्तकर्ताओं को एकल इकाई के रूप में समग्र ऊतकों, जैसे, मांसपेशियों, त्वचा, वाहिका को स्थानांतरित करता है। हालांकि, वीसीए को दीर्घकालिक इम्यूनोसप्रेशन की आवश्यकता होती है, जो दवा विषाक्तता, अवसरवादी संक्रमण और दुर्भावनाओं 4,5,6 की ओर जाता है।
ऊतक-इंजीनियर एसेलुलर मचान इन सीमाओं का एक संभावित समाधानहैं। एककोशिकीय ऊतक मचानों को डीसेल्युलराइजेशन विधियों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जो अंतर्निहित बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) माइक्रोआर्किटेक्चर को संरक्षित करते हुए देशी ऊतकों से सेलुलर सामग्री को हटा देते हैं। ऊतक इंजीनियरिंग में सिंथेटिक सामग्री के उपयोग के विपरीत, जैविक रूप से व्युत्पन्न मचानों का उपयोग एक बायोमिमेटिक ईसीएम सब्सट्रेट प्रदान करता है जो जैव-रासायनिकता और नैदानिक अनुवाद की क्षमता की अनुमति देताहै। डीसेलुलराइजेशन के बाद, प्राप्तकर्ता-विशिष्ट कोशिकाओं के साथ मचानों का बाद में पुनर्कोशिकीयकरण कार्यात्मक, संवहनी ऊतक उत्पन्न कर सकता है जिसमें बहुत कमइम्युनोजेनेसिटी 9,10,11 होती है। छिड़काव डीसेलुलराइजेशन तकनीकों का उपयोग करके एककोशिकीय ऊतकों को प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी प्रोटोकॉल विकसित करके, ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला को इंजीनियर किया जा सकता है। बदले में, इस तकनीक पर निर्माण अधिक जटिल ऊतकों के लिए आवेदन की अनुमति देता है। आज तक, संवहनी नरम ऊतकों के छिड़काव डीसेल्युलराइजेशन की जांच सरल संवहनी ऊतकों का उपयोग करके की गई है जैसे कि कृंतक12, पोर्सिन13 और मानव मॉडल14 में पूर्ण मोटाई फैसिओक्यूटेनियस फ्लैप, साथ ही पोर्सिन रेक्टस एब्डोमिनिस कंकाल की मांसपेशी15। इसके अतिरिक्त, जटिल संवहनी ऊतकों को भी छिड़काव डीसेल्यूलराइज्ड किया गया है जैसा कि पोर्सिन और मानव कान16,17 मॉडल और मानव पूर्ण-चेहरे ग्राफ्ट मॉडल18 में दिखाया गया है।
यहां, प्रोटोकॉल जैविक रूप से व्युत्पन्न ईसीएम मचानों का उपयोग करके संवहनी मुक्त फ्लैप के विकोशिकीयकरण का वर्णन करता है। हम तीन चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक फ्लैप के विकोशिकीयकरण को प्रस्तुत करते हैं: 1) ओमेंटम, 2) टेन्सर प्रावरणी लता, और 3) रेडियल अग्रभाग, जिनमें से सभी पुनर्निर्माण सर्जरी में नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले वर्कहॉर्स फ्लैप के प्रतिनिधि हैं और पहले ऊतक विकोशिकीयकरण के संदर्भ में पशु अध्ययन में जांच नहीं की गई है। ये बायोइंजीनियर्ड फ्लैप एक बहुमुखी और आसानी से उपलब्ध मंच प्रदान करते हैं जिसमें बड़े नरम ऊतक दोष की मरम्मत और पुनर्निर्माण के क्षेत्र में उपयोग के लिए नैदानिक अनुप्रयोगों की क्षमता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तावित प्रोटोकॉल पोर्सिन-व्युत्पन्न फ्लैप की एक श्रृंखला को डीसेल्यूलराइज करने के लिए कम सांद्रता एसडीएस के छिड़काव का उपयोग करता है। इस प्रक्रिया के साथ, एककोशिकीय ओमेंटम, टेंसर प्रावरणी लता, औ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं
Materials
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering – Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
