يصف البروتوكول الشراء الجراحي وإزالة الخلايا اللاحقة لسدائل الخنازير الوعائية عن طريق تروية منظف كبريتات دوديسيل الصوديوم من خلال الأوعية الدموية في مفاعل حيوي مخصص للتروية.
تؤدي عيوب الأنسجة الرخوة كبيرة الحجم إلى عجز وظيفي ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على نوعية حياة المريض. على الرغم من أنه يمكن إجراء إعادة الإعمار الجراحي باستخدام نقل السديلة الحرة الذاتية أو زرع الأوعية الدموية المركبة (VCA) ، إلا أن هذه الطرق لها أيضا عيوب. تحد مشكلات مثل المراضة في موقع المتبرع وتوافر الأنسجة من نقل السديلة الحرة ذاتية المنشأ ، في حين أن كبت المناعة يمثل قيدا كبيرا على VCA. تمثل الأنسجة المهندسة في الجراحة الترميمية باستخدام طرق إزالة الخلايا / إعادة الخلايا حلا ممكنا. يتم إنشاء الأنسجة منزوعة الخلايا باستخدام طرق تزيل المواد الخلوية الأصلية مع الحفاظ على البنية الدقيقة الأساسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM). يمكن بعد ذلك إعادة تشكيل هذه السقالات اللاخلوية لاحقا بخلايا خاصة بالمستلم.
يفصل هذا البروتوكول طرق الشراء وإزالة الخلايا المستخدمة لتحقيق السقالات اللاخلوية في نموذج الخنازير. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر أيضا وصفا لتصميم وإعداد المفاعل الحيوي للتروية. تشمل اللوحات الثرب الخنزير ، واللفافة الموترة ، والساعد الكعبري. يتم إجراء إزالة الخلايا عن طريق التروية خارج الجسم الحي لمنظف كبريتات دوديسيل الصوديوم منخفض التركيز (SDS) متبوعا بمعالجة إنزيم DNase وتعقيم حمض البيراسيتيك في مفاعل حيوي مخصص للتروية.
تتميز عملية إزالة الخلايا الناجحة للأنسجة بمظهر أبيض معتم من اللوحات بشكل مجهري. تظهر اللوحات اللاخلوية عدم وجود نوى على تلطيخ نسيجي وانخفاض كبير في محتوى الحمض النووي. يمكن استخدام هذا البروتوكول بكفاءة لإنشاء سقالات الأنسجة الرخوة منزوعة الخلايا مع ECM المحفوظة والهندسة المعمارية الدقيقة الوعائية. يمكن استخدام هذه السقالات في دراسات إعادة التشكيل الخلوي اللاحقة ولديها القدرة على الترجمة السريرية في الجراحة الترميمية.
يمكن أن تؤدي الإصابة الرضحية وإزالة الورم إلى عيوب كبيرة ومعقدة في الأنسجة الرخوة. يمكن أن تضعف هذه العيوب نوعية حياة المريض ، وتسبب فقدان الوظيفة ، وتؤدي إلى إعاقة دائمة. في حين أن تقنيات مثل نقل رفرف الأنسجة الذاتية قد تم ممارستها بشكل شائع ، فإن المشكلات المتعلقة بتوافر السديلة ومراضة موقع المتبرع هي قيود رئيسية1،2،3. زرع الأوعية الدموية المركب (VCA) هو بديل واعد ينقل الأنسجة المركبة ، على سبيل المثال ، العضلات والجلد والأوعية الدموية ، كوحدة واحدة إلى المتلقين. ومع ذلك ، يتطلب VCA كبت المناعة على المدى الطويل ، مما يؤدي إلى سمية الدواء ، والالتهابات الانتهازية ، والأورام الخبيثة4،5،6.
السقالات اللاخلوية المهندسة بالأنسجة هي حل محتمل لهذه القيود7. يمكن الحصول على سقالات الأنسجة اللاخلوية باستخدام طرق إزالة الخلايا ، والتي تزيل المواد الخلوية من الأنسجة الأصلية مع الحفاظ على البنية الدقيقة الأساسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM). على عكس استخدام المواد الاصطناعية في هندسة الأنسجة ، فإن استخدام السقالات المشتقة بيولوجيا يوفر ركيزة ECM محاكاة حيوية تسمح بالتوافق الحيوي وإمكانية الترجمة السريرية8. بعد إزالة الخلايا ، يمكن أن تؤدي إعادة الخلايا اللاحقة للسقالات بخلايا خاصة بالمتلقي إلى توليد أنسجة وظيفية وعائية مع القليل من المناعة9،10،11. من خلال تطوير بروتوكول فعال للحصول على الأنسجة اللاخلوية باستخدام تقنيات إزالة الخلايا من التروية ، يمكن هندسة مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة. في المقابل ، يسمح البناء على هذه التقنية بالتطبيق على أنسجة أكثر تعقيدا. حتى الآن ، تم التحقيق في إزالة الخلايا من الأنسجة الرخوة الوعائية باستخدام أنسجة وعائية بسيطة مثل رفرف لفافة جلدية كامل السماكة في القوارض 12 ، والخنازير13 ، والنماذج البشرية 14 ، وكذلك الخنزير المستقيم البطني العضلات الهيكلية15. بالإضافة إلى ذلك ، تم أيضا إزالة خلايا التروية من الأنسجة الوعائية المعقدة كما هو موضح في نماذج الخنازير والأذن البشرية 16,17 ونماذج الكسب غير المشروع للوجه البشري18.
هنا ، يصف البروتوكول إزالة الخلايا من اللوحات الحرة الوعائية باستخدام سقالات ECM المشتقة بيولوجيا. نقدم إزالة الخلايا من ثلاث لوحات ذات صلة سريريا: 1) الثرب ، 2) اللفافة الموترة ، و 3) الساعد الكعبري ، وكلها تمثل اللوحات العمود الفقري المستخدمة بشكل روتيني في الجراحة الترميمية ولم يتم فحصها مسبقا في الدراسات التي أجريت على الحيوانات في سياق إزالة الخلايا من الأنسجة. توفر هذه اللوحات المهندسة بيولوجيا منصة متعددة الاستخدامات ومتاحة بسهولة ولديها القدرة على التطبيقات السريرية للاستخدام في مجال إصلاح وإعادة بناء عيوب الأنسجة الرخوة الكبيرة.
يستخدم البروتوكول المقترح نضح SDS منخفض التركيز لإزالة الخلايا من مجموعة من اللوحات المشتقة من الخنازير. مع هذا الإجراء ، يمكن إزالة الثرب اللاخلوي ، واللفافة الموترة ، واللوحات الساعدية الكعبرية بنجاح باستخدام بروتوكول يفضل SDS منخفض التركيز. حددت تجارب التحسين الأولية أن SDS بتركيز منخفض (…
The authors have nothing to disclose.
اي
0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |