Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado
Summary
El protocolo describe la obtención quirúrgica y la posterior descelularización de colgajos porcinos vascularizados mediante la perfusión de detergente dodecil sulfato de sodio a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado.
Abstract
Los defectos de tejido blando de gran volumen conducen a déficits funcionales y pueden afectar en gran medida la calidad de vida del paciente. Aunque la reconstrucción quirúrgica se puede realizar mediante transferencia autóloga de colgajo libre o alotrasplante compuesto vascularizado (VCA), tales métodos también tienen desventajas. Problemas como la morbilidad del sitio donante y la disponibilidad de tejido limitan la transferencia autóloga de colgajo libre, mientras que la inmunosupresión es una limitación significativa de VCA. Los tejidos diseñados en cirugía reconstructiva utilizando métodos de descelularización/recelularización representan una posible solución. Los tejidos descelularizados se generan utilizando métodos que eliminan el material celular nativo al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). Estos andamios acelulares pueden ser posteriormente recelularizados con células específicas del receptor.
Este protocolo detalla los métodos de adquisición y descelularización utilizados para lograr andamios acelulares en un modelo de cerdo. Además, también proporciona una descripción del diseño y la configuración del biorreactor de perfusión. Los colgajos incluyen el epiplón porcino, la fascia lata tensora y el antebrazo radial. La descelularización se realiza mediante perfusión ex vivo de detergente de dodecil sulfato de sodio (SDS) de baja concentración, seguido de un tratamiento con enzimas DNasa y esterilización con ácido peracético en un biorreactor de perfusión personalizado.
La descelularización tisular exitosa se caracteriza por una apariencia blanco-opaca de colgajos macroscópicamente. Los colgajos acelulares muestran la ausencia de núcleos en la tinción histológica y una reducción significativa en el contenido de ADN. Este protocolo se puede utilizar de manera eficiente para generar andamios de tejidos blandos descelularizados con ECM preservada y microarquitectura vascular. Tales andamios se pueden utilizar en estudios posteriores de recelularización y tienen el potencial de traducción clínica en cirugía reconstructiva.
Introduction
La lesión traumática y la extirpación del tumor pueden conducir a defectos grandes y complejos de tejidos blandos. Estos defectos pueden afectar la calidad de vida del paciente, causar pérdida de la función y provocar una discapacidad permanente. Si bien técnicas como la transferencia de colgajo de tejido autólogo se han practicado comúnmente, los problemas con la disponibilidad de colgajo y la morbilidad del sitio donante son limitaciones importantes 1,2,3. El alotrasplante compuesto vascularizado (ACV) es una alternativa prometedora que transfiere tejidos compuestos, por ejemplo, músculo, piel, vasculatura, como una sola unidad a los receptores. Sin embargo, VCA requiere inmunosupresión a largo plazo, lo que conduce a toxicidad farmacológica, infecciones oportunistas y neoplasias malignas 4,5,6.
Los andamios acelulares de ingeniería tisular son una solución potencial a estas limitaciones7. Los andamios de tejido acelular se pueden obtener utilizando métodos de descelularización, que eliminan el material celular de los tejidos nativos al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). En contraste con el uso de materiales sintéticos en la ingeniería de tejidos, el uso de andamios derivados biológicamente ofrece un sustrato de ECM biomimético que permite la biocompatibilidad y el potencial para la traducción clínica8. Después de la descelularización, la posterior recelularización de andamios con células específicas del receptor puede generar tejidos funcionales, vascularizados y con poca o ninguna inmunogenicidad 9,10,11. Mediante el desarrollo de un protocolo eficaz para obtener tejidos acelulares utilizando técnicas de descelularización de perfusión, se puede diseñar una amplia gama de tipos de tejidos. A su vez, la construcción de esta técnica permite la aplicación a tejidos más complejos. Hasta la fecha, la descelularización por perfusión de tejidos blandos vascularizados se ha investigado utilizando tejidos vascularizados simples, como un colgajo fasciocutáneo de espesor total en roedores 12, porcinos13 y modelos humanos 14, así como músculo esquelético recto abdominal porcino15. Además, los tejidos vascularizados complejos también han sido descelularizados por perfusión, como se demostró en los modelos de oído porcino y humano 16,17 y en los modelos de injerto de cara completa humana18.
Aquí, el protocolo describe la descelularización de colgajos libres vascularizados utilizando andamios de ECM derivados biológicamente. Presentamos la descelularización de tres colgajos clínicamente relevantes: 1) el epiplón, 2) el tensor de la fascia lata, y 3) el antebrazo radial, todos los cuales son representativos de los colgajos de caballo de batalla utilizados rutinariamente en cirugía reconstructiva y no han sido examinados previamente en estudios con animales en el contexto de la descelularización tisular. Estos colgajos de bioingeniería ofrecen una plataforma versátil y fácilmente disponible que tiene el potencial de aplicaciones clínicas para su uso en el campo de la reparación y reconstrucción de grandes defectos de tejidos blandos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo propuesto utiliza la perfusión de SDS de baja concentración para descelularizar una gama de colgajos derivados de porcinos. Con este procedimiento, el epiplón acelular, el tensor de la fascia lata y los colgajos radiales del antebrazo se pueden descelularizar con éxito utilizando un protocolo que favorece la baja concentración de SDS. Los experimentos preliminares de optimización han determinado que la SDS a una concentración baja (0,05%) entre 2 días y 5 días es capaz de eliminar material celular p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno
Materials
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
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