Ce protocole décrit les méthodes d’imagerie par résonance magnétique, d’effacement et d’immunomarquage de cerveaux de souris intacts à l’aide d’iDISCO+, suivies d’une description détaillée de l’imagerie à l’aide de la microscopie à feuille de lumière et des analyses en aval à l’aide de NuMorph.
Le nettoyage des tissus suivi de la microscopie à feuille de lumière (LSFM) permet l’imagerie à résolution cellulaire de la structure cérébrale intacte, permettant une analyse quantitative des changements structurels causés par des perturbations génétiques ou environnementales. L’imagerie du cerveau entier permet une quantification plus précise des cellules et l’étude des différences spécifiques à la région qui peuvent être manquées avec la microscopie couramment utilisée des tissus sectionnés physiquement. L’utilisation de la microscopie à feuille de lumière pour imager les cerveaux dégagés augmente considérablement la vitesse d’acquisition par rapport à la microscopie confocale. Bien que ces images produisent de très grandes quantités de données structurelles sur le cerveau, la plupart des outils informatiques qui effectuent la quantification des caractéristiques dans les images de tissus clairsemés se limitent à compter des populations de cellules clairsemées, plutôt que tous les noyaux.
Ici, nous démontrons NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un groupe d’outils d’analyse, pour quantifier tous les noyaux et marqueurs nucléaires dans les régions annotées d’un cerveau de souris postnatal du jour 4 (P4) après élimination et imagerie au microscope à feuille de lumière. Nous décrivons l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour mesurer le volume cérébral avant le rétrécissement causé par les étapes de déshydratation de l’élimination des tissus, le nettoyage des tissus à l’aide de la méthode iDISCO +, y compris l’immunomarquage, suivi de la microscopie à feuille de lumière à l’aide d’une plate-forme disponible dans le commerce pour imager les cerveaux de souris à la résolution cellulaire. Nous démontrons ensuite ce pipeline d’analyse d’images à l’aide de NuMorph, qui est utilisé pour corriger les différences d’intensité, assembler des tuiles d’image, aligner plusieurs canaux, compter les noyaux et annoter les régions du cerveau grâce à l’enregistrement dans des atlas accessibles au public.
Nous avons conçu cette approche à l’aide de protocoles et de logiciels accessibles au public, permettant à tout chercheur disposant du microscope et des ressources informatiques nécessaires pour effectuer ces techniques. Ces outils de nettoyage tissulaire, d’imagerie et de calcul permettent de mesurer et de quantifier l’organisation tridimensionnelle (3D) des types cellulaires dans le cortex et devraient être largement applicables à toute conception d’étude de souris de type sauvage / knockout.
L’imagerie du cerveau entier à une résolution unicellulaire est un défi important en neurosciences. Les images cérébrales à résolution cellulaire permettent une analyse détaillée et une cartographie au niveau du système des circuits cérébraux et de la façon dont ces circuits sont perturbés par des facteurs de risque génétiques ou environnementaux de troubles neuropsychiatriques, le comportement cellulaire dans les embryons en développement, ainsi que les circuits neuronaux dans le cerveau adulte 1,2,3. Il existe de multiples méthodes histologiques qui permettent d’obtenir des images haute résolution du cerveau 3D reconstruit; cependant, ces techniques nécessitent un équipement spécialisé coûteux, peuvent ne pas être compatibles avec l’immunomarquage, et la nature bidimensionnelle (2D) de certaines méthodes peut entraîner des lésions tissulaires et un cisaillement pendant la sectionnement 4,5.
Les progrès récents ont fourni une approche alternative pour l’imagerie de cerveaux entiers qui ne nécessite pas de section de tissu; Ils impliquent l’utilisation de l’élimination des tissus pour rendre les cerveaux transparents. La transparence est obtenue dans la plupart des méthodes de nettoyage tissulaire en éliminant les lipides, car ils sont une source majeure de diffusion de la lumière, et en faisant correspondre l’indice de réfraction (RI) de l’objet avec l’IR de la solution d’immersion de l’échantillon pendant l’imagerie. La lumière peut alors traverser la frontière entre les matériaux sans être dispersée 6,7,8,9.
Les méthodes de nettoyage tissulaire, telles que iDISCO+, sont souvent combinées à une imagerie 3D rapide utilisant la microscopie d’excitation monophotonique, telle que LSFM 6,7,10. Dans les tissus transparents marqués avec un fluorophore, la microscopie à fluorescence à feuille de lumière présente des coupes par excitation avec un mince plan de lumière11. Le principal avantage de LSFM est qu’une seule section optique est éclairée à la fois, toute la fluorescence des molécules de cette section étant excitée, ce qui minimise le photoblanchiment. De plus, l’imagerie d’une tranche optique entière permet de détecter cette tranche excitée par caméra, ce qui augmente la vitesse par rapport au balayage ponctuel12. LSFM produit de manière non destructive des sections optiques bien enregistrées qui conviennent à la reconstruction 3D.
Alors que la méthode iDISCO+ permet un nettoyage des tissus peu coûteux en ~3 semaines, les étapes de déshydratation du protocole peuvent entraîner un rétrécissement des tissus et une altération potentielle de la morphologie de l’échantillon, affectant ainsi les mesures volumétriques 6,10. L’ajout d’une méthode d’imagerie secondaire, telle que l’IRM, à utiliser avant la procédure de nettoyage des tissus peut mesurer le degré de rétrécissement induit par le nettoyage des tissus dans l’échantillon. Au cours des étapes de déshydratation, les différences de propriétés mécaniques entre la substance grise et la substance blanche peuvent entraîner des déformations non uniformes de la matière cérébrale, entraînant des déformations volumétriques dissemblables induites par la clairance tissulaire entre les échantillons de type sauvage et mutant, et peuvent confondre les interprétations des différences volumétriques dans ces échantillons10,13 . L’IRM est réalisée en perfusant d’abord l’animal avec un agent de contraste (p. ex. gadolinium), puis en incubant le tissu extrait d’intérêt dans une solution d’immersion (p. ex. fombline) avant l’imagerie14. L’IRM est compatible avec le nettoyage tissulaire et la réalisation de LSFM sur le même échantillon.
LSFM est souvent utilisé pour créer des images de microscopie à grande échelle pour la visualisation qualitative du tissu cérébral d’intérêt plutôt que pour l’évaluation quantitative de la structure du cerveau (Figure 1). Sans évaluation quantitative, il est difficile de démontrer les différences structurelles résultant d’agressions génétiques ou environnementales. À mesure que les technologies de nettoyage et d’imagerie des tissus s’améliorent, ainsi que la diminution des coûts de stockage et de puissance de calcul, la quantification des localisations des types cellulaires dans le tissu d’intérêt devient plus accessible, ce qui permet à un plus grand nombre de chercheurs d’inclure ces données dans leurs études.
Avec plus de 100 millions de cellules dans le cerveau de la souris15 et des séances d’imagerie du cerveau entier qui peuvent générer des téraoctets de données, il existe une demande accrue d’outils d’analyse d’images avancés qui permettent une quantification précise des caractéristiques des images, telles que les cellules. Il existe une foule de méthodes de segmentation pour les images effacées par les tissus qui appliquent un seuil pour l’intensité de la coloration nucléaire et filtrent les objets avec des formes, des tailles ou des densités prédéfinies10,16,17,18. Cependant, des interprétations inexactes des résultats peuvent résulter de variations de paramètres tels que la taille de la cellule, le contraste de l’image et l’intensité de l’étiquetage. Cet article décrit notre protocole établi pour quantifier les noyaux cellulaires dans le cerveau de la souris. Tout d’abord, nous détaillons les étapes de collecte de tissus du cerveau de souris P4, suivies d’un protocole de nettoyage tissulaire et d’immunomarquage optimisé à partir de la méthode iDISCO+10 accessible au public. Deuxièmement, nous décrivons l’acquisition d’images à l’aide de l’IRM et de la microscopie à feuille de lumière, y compris les paramètres utilisés pour capturer des images. Enfin, nous décrivons et démontrons NuMorph19, un ensemble d’outils d’analyse d’images que notre groupe a développés et qui permet la quantification spécifique du type cellulaire après nettoyage des tissus, l’immunomarquage avec des marqueurs nucléaires et l’imagerie par feuille de lumière des régions annotées.
Les méthodes de nettoyage des tissus sont des techniques utiles pour mesurer l’organisation cellulaire 3D du cerveau. Il existe une foule de méthodes de nettoyage des tissus décrites dans la littérature, chacune avec ses avantages et ses limites 6,7,8,9. Les options d’outils informatiques pour analyser les types de cellules dans les images effacées des tissus sont relativement limitée…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par le NIH (R01MH121433, R01MH118349 et R01MH120125 à JLS et R01NS110791 à GW) et la Fondation de l’espoir. Nous remercions Pablo Ariel, du Laboratoire des services de microscopie, de son aide dans l’imagerie des échantillons. Le laboratoire des services de microscopie du département de pathologie et de médecine de laboratoire est soutenu en partie par la subvention P30 CA016086 du Cancer Center Core Support à l’Université de Caroline du Nord (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Le noyau de microscopie en neurosciences est soutenu par la subvention P30 NS045892. La recherche rapportée dans cette publication a été financée en partie par la subvention de soutien institutionnel 2016-IDG-1016 du North Carolina Biotech Center.
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner | Bruker Biospec | Horizontal Bore Animal MRI System | |
Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher-Scientific | ICN19605590 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
EVO 860 4TB external SSD | |||
Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | perfluoropolyether lubricant |
gadolinium contrast agent (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
gadolinium contrast agent(ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | Dissolved in H2O to 10 mg/mL |
Hydrogen peroxide solution, 30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
ImSpector Pro | LaVision BioTec | Microscope image acquisition software | |
ITK Snap | segmentation software | ||
Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective | Olympus | ||
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Dissolved in 1x PBS to 4% |
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Diluted to 1x in H2O |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002-100G | Dissolved in H2O to 10% |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
Tergitol type NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
Zyla sCMOS Camera | Andor | Complementary metal oxide semiconductor camera | |
Antibody | Working concentration | ||
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1:400) |