Imagerie unicellulaire du cerveau entier et analyse de cerveaux de souris néonatales intactes à l’aide de l’IRM, du nettoyage des tissus et de la microscopie à feuille de lumière

Summary

Ce protocole décrit les méthodes d’imagerie par résonance magnétique, d’effacement et d’immunomarquage de cerveaux de souris intacts à l’aide d’iDISCO+, suivies d’une description détaillée de l’imagerie à l’aide de la microscopie à feuille de lumière et des analyses en aval à l’aide de NuMorph.

Abstract

Le nettoyage des tissus suivi de la microscopie à feuille de lumière (LSFM) permet l’imagerie à résolution cellulaire de la structure cérébrale intacte, permettant une analyse quantitative des changements structurels causés par des perturbations génétiques ou environnementales. L’imagerie du cerveau entier permet une quantification plus précise des cellules et l’étude des différences spécifiques à la région qui peuvent être manquées avec la microscopie couramment utilisée des tissus sectionnés physiquement. L’utilisation de la microscopie à feuille de lumière pour imager les cerveaux dégagés augmente considérablement la vitesse d’acquisition par rapport à la microscopie confocale. Bien que ces images produisent de très grandes quantités de données structurelles sur le cerveau, la plupart des outils informatiques qui effectuent la quantification des caractéristiques dans les images de tissus clairsemés se limitent à compter des populations de cellules clairsemées, plutôt que tous les noyaux.

Ici, nous démontrons NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un groupe d’outils d’analyse, pour quantifier tous les noyaux et marqueurs nucléaires dans les régions annotées d’un cerveau de souris postnatal du jour 4 (P4) après élimination et imagerie au microscope à feuille de lumière. Nous décrivons l’imagerie par résonance magnétique (IRM) pour mesurer le volume cérébral avant le rétrécissement causé par les étapes de déshydratation de l’élimination des tissus, le nettoyage des tissus à l’aide de la méthode iDISCO +, y compris l’immunomarquage, suivi de la microscopie à feuille de lumière à l’aide d’une plate-forme disponible dans le commerce pour imager les cerveaux de souris à la résolution cellulaire. Nous démontrons ensuite ce pipeline d’analyse d’images à l’aide de NuMorph, qui est utilisé pour corriger les différences d’intensité, assembler des tuiles d’image, aligner plusieurs canaux, compter les noyaux et annoter les régions du cerveau grâce à l’enregistrement dans des atlas accessibles au public.

Nous avons conçu cette approche à l’aide de protocoles et de logiciels accessibles au public, permettant à tout chercheur disposant du microscope et des ressources informatiques nécessaires pour effectuer ces techniques. Ces outils de nettoyage tissulaire, d’imagerie et de calcul permettent de mesurer et de quantifier l’organisation tridimensionnelle (3D) des types cellulaires dans le cortex et devraient être largement applicables à toute conception d’étude de souris de type sauvage / knockout.

Introduction

L’imagerie du cerveau entier à une résolution unicellulaire est un défi important en neurosciences. Les images cérébrales à résolution cellulaire permettent une analyse détaillée et une cartographie au niveau du système des circuits cérébraux et de la façon dont ces circuits sont perturbés par des facteurs de risque génétiques ou environnementaux de troubles neuropsychiatriques, le comportement cellulaire dans les embryons en développement, ainsi que les circuits neuronaux dans le cerveau adulte ^1,2,3. Il existe de multiples méthodes histologiques qui permettent d’obtenir des images haute résolution du cerveau 3D reconstruit; cependant, ces techniques nécessitent un équipement spécialisé coûteux, peuvent ne pas être compatibles avec l’immunomarquage, et la nature bidimensionnelle (2D) de certaines méthodes peut entraîner des lésions tissulaires et un cisaillement pendant la sectionnement ^4,5.

Les progrès récents ont fourni une approche alternative pour l’imagerie de cerveaux entiers qui ne nécessite pas de section de tissu; Ils impliquent l’utilisation de l’élimination des tissus pour rendre les cerveaux transparents. La transparence est obtenue dans la plupart des méthodes de nettoyage tissulaire en éliminant les lipides, car ils sont une source majeure de diffusion de la lumière, et en faisant correspondre l’indice de réfraction (RI) de l’objet avec l’IR de la solution d’immersion de l’échantillon pendant l’imagerie. La lumière peut alors traverser la frontière entre les matériaux sans être dispersée 6,7,8,9.

Les méthodes de nettoyage tissulaire, telles que iDISCO+, sont souvent combinées à une imagerie 3D rapide utilisant la microscopie d’excitation monophotonique, telle que LSFM 6,7,10. Dans les tissus transparents marqués avec un fluorophore, la microscopie à fluorescence à feuille de lumière présente des coupes par excitation avec un mince plan de lumière¹¹. Le principal avantage de LSFM est qu’une seule section optique est éclairée à la fois, toute la fluorescence des molécules de cette section étant excitée, ce qui minimise le photoblanchiment. De plus, l’imagerie d’une tranche optique entière permet de détecter cette tranche excitée par caméra, ce qui augmente la vitesse par rapport au balayage ponctuel¹². LSFM produit de manière non destructive des sections optiques bien enregistrées qui conviennent à la reconstruction 3D.

Alors que la méthode iDISCO+ permet un nettoyage des tissus peu coûteux en ~3 semaines, les étapes de déshydratation du protocole peuvent entraîner un rétrécissement des tissus et une altération potentielle de la morphologie de l’échantillon, affectant ainsi les mesures volumétriques ^6,10. L’ajout d’une méthode d’imagerie secondaire, telle que l’IRM, à utiliser avant la procédure de nettoyage des tissus peut mesurer le degré de rétrécissement induit par le nettoyage des tissus dans l’échantillon. Au cours des étapes de déshydratation, les différences de propriétés mécaniques entre la substance grise et la substance blanche peuvent entraîner des déformations non uniformes de la matière cérébrale, entraînant des déformations volumétriques dissemblables induites par la clairance tissulaire entre les échantillons de type sauvage et mutant, et peuvent confondre les interprétations des différences volumétriques dans ces échantillons^10,13 . L’IRM est réalisée en perfusant d’abord l’animal avec un agent de contraste (p. ex. gadolinium), puis en incubant le tissu extrait d’intérêt dans une solution d’immersion (p. ex. fombline) avant l’imagerie¹⁴. L’IRM est compatible avec le nettoyage tissulaire et la réalisation de LSFM sur le même échantillon.

LSFM est souvent utilisé pour créer des images de microscopie à grande échelle pour la visualisation qualitative du tissu cérébral d’intérêt plutôt que pour l’évaluation quantitative de la structure du cerveau (Figure 1). Sans évaluation quantitative, il est difficile de démontrer les différences structurelles résultant d’agressions génétiques ou environnementales. À mesure que les technologies de nettoyage et d’imagerie des tissus s’améliorent, ainsi que la diminution des coûts de stockage et de puissance de calcul, la quantification des localisations des types cellulaires dans le tissu d’intérêt devient plus accessible, ce qui permet à un plus grand nombre de chercheurs d’inclure ces données dans leurs études.

Avec plus de 100 millions de cellules dans le cerveau de la souris¹⁵ et des séances d’imagerie du cerveau entier qui peuvent générer des téraoctets de données, il existe une demande accrue d’outils d’analyse d’images avancés qui permettent une quantification précise des caractéristiques des images, telles que les cellules. Il existe une foule de méthodes de segmentation pour les images effacées par les tissus qui appliquent un seuil pour l’intensité de la coloration nucléaire et filtrent les objets avec des formes, des tailles ou des densités prédéfinies^10,16,17,18. Cependant, des interprétations inexactes des résultats peuvent résulter de variations de paramètres tels que la taille de la cellule, le contraste de l’image et l’intensité de l’étiquetage. Cet article décrit notre protocole établi pour quantifier les noyaux cellulaires dans le cerveau de la souris. Tout d’abord, nous détaillons les étapes de collecte de tissus du cerveau de souris P4, suivies d’un protocole de nettoyage tissulaire et d’immunomarquage optimisé à partir de la méthode iDISCO+¹⁰ accessible au public. Deuxièmement, nous décrivons l’acquisition d’images à l’aide de l’IRM et de la microscopie à feuille de lumière, y compris les paramètres utilisés pour capturer des images. Enfin, nous décrivons et démontrons NuMorph¹⁹, un ensemble d’outils d’analyse d’images que notre groupe a développés et qui permet la quantification spécifique du type cellulaire après nettoyage des tissus, l’immunomarquage avec des marqueurs nucléaires et l’imagerie par feuille de lumière des régions annotées.

Protocol

Toutes les souris ont été utilisées conformément et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. 1. Dissection et perfusion de souris NOTE: Les dissections suivantes ont été effectuées sur des souris P4 et P14 à l’aide d’une seringue. Le volume de liquide de perfusion variera en fonction de l’âge de l’animal. PerfusionATTENTION : Le paraf…

Representative Results

Comme le protocole iDISCO+ introduit un rétrécissement tissulaire important, facilement perceptible à l’œil nu (Figure 2B), nous avons ajouté une étape IRM à ce pipeline avant le nettoyage tissulaire pour quantifier le rétrécissement induit par le nettoyage des tissus. Le flux de travail commence par le retrait du tissu non cérébral de l’image IRM (Figure 2C). Ensuite, une transformation rigide (3 angles de translation et 3 angles de rotation) est…

Discussion

Les méthodes de nettoyage des tissus sont des techniques utiles pour mesurer l’organisation cellulaire 3D du cerveau. Il existe une foule de méthodes de nettoyage des tissus décrites dans la littérature, chacune avec ses avantages et ses limites 6,7,8,9. Les options d’outils informatiques pour analyser les types de cellules dans les images effacées des tissus sont relativement limitée…

Materials

Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)