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Neuroscience

पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी का उपयोग करके एक प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस माउस मॉडल में इमेजिंग सीडी 19 + बी कोशिकाएं

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64133
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Radiology, Stanford University, 2Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

यह पेपर मानव-विशिष्ट एंटी-सीडी 19 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को रेडियोलेबल करने के लिए कार्यप्रणाली का विवरण देता है और विवो पीईटी इमेजिंग, एक्स विवो गामा काउंटिंग और ऑटोरेडियोग्राफी दृष्टिकोण का उपयोग करके केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और मल्टीपल स्केलेरोसिस के माउस मॉडल के परिधीय ऊतकों में बी कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए इसका उपयोग कैसे करें।

Abstract

मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) युवा वयस्कों को प्रभावित करने वाली सबसे आम डिमाइलेटिंग सेंट्रल नर्वस सिस्टम (सीएनएस) बीमारी है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर बीमारी बढ़ने पर न्यूरोलॉजिकल घाटे और विकलांगता होती है। बी लिम्फोसाइट्स एमएस पैथोलॉजी में एक जटिल और महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और नैदानिक परीक्षणों में कई चिकित्सीय का लक्ष्य हैं। वर्तमान में, विशिष्ट एंटी-बी सेल उपचारों के लिए रोगियों का सही चयन करने या सीएनएस और परिधीय अंगों में बी सेल लोड पर इन उपचारों के प्रभावों को गैर-आक्रामक रूप से निर्धारित करने का कोई तरीका नहीं है। पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग में जीवित विषयों में बी कोशिकाओं के विवो स्थानिक वितरण और बोझ के बारे में अत्यधिक विशिष्ट, मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने की भारी क्षमता है।

यह पेपर एमएस के एक अच्छी तरह से स्थापित बी सेल-संचालित माउस मॉडल, प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) में मानव सीडी 19 + बी कोशिकाओं के लिए विशिष्ट पीईटी ट्रेसर को संश्लेषित और नियोजित करने के तरीकों की रिपोर्ट करता है, जो मानव पुनः संयोजक माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन 1-125 से प्रेरित है। यहां वर्णित विवो पीईटी इमेजिंग में मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में सीडी 19 + बी कोशिकाओं का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुकूलित तकनीकें हैं। इसके अतिरिक्त, यह पेपर सीएनएस ऊतकों में सीडी 19 ट्रेसर बाइंडिंग के उच्च-रिज़ॉल्यूशन ऑटोरेडियोग्राफी के साथ-साथ अस्थि मज्जा, रीढ़ की हड्डी और प्लीहा सहित रोग-प्रासंगिक अंगों की पूर्व विवो गामा गिनती के लिए सुव्यवस्थित तरीकों की रिपोर्ट करता है।

Introduction

एमएस एक प्रतिरक्षा-मध्यस्थता न्यूरोलॉजिकल विकार है; प्रत्येक रोगी में अद्वितीय प्रस्तुति रोगियों और चिकित्सकों दोनों के लिए प्रबंधन को चुनौतीपूर्ण बनासकती है। रोग स्वयं मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में डिमाइलेटिंग घावों और प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ की उपस्थिति की विशेषता है, जिसके परिणामस्वरूप शारीरिक और संज्ञानात्मक हानिहोती है। पारंपरिक प्रतिमान कि एमएस एक टी सेल-मध्यस्थता वाली बीमारी है, को पहली बार रीटक्सिमैब3 के एक ऐतिहासिक चरण द्वितीय नैदानिक परीक्षण में चुनौती दी गई थी, जो बी कोशिकाओं के सीडी 20+ उप-समूह को लक्षित करने वाली एक चिकित्सा थी। अतिरिक्त बी सेल उपचार तब से विकसित किए गए हैं जो सीडी 1 94 को लक्षित करते हैं, एक पैन बी सेल बायोमार्कर जो बी कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला पर व्यक्त किया जाता है, जो नैदानिक और चिकित्सीय रूप से फायदेमंद दोनों हो सकता है। इसके अलावा, उपचार प्रभावकारिता का आकलन करने के मौजूदा तरीके (यानी, रिलैप्स और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग [एमआरआई] गतिविधि की संख्या की निगरानी) प्रतिक्रिया के शुरुआती उपायों को वहन नहीं करते हैं- इस प्रकार रोगियों को उप-चिकित्सा चयन और अनुकूलन के कारण सीएनएस क्षति के महत्वपूर्ण जोखिम में डाल दिया जाता है। इसलिए, एमएस रोगियों की सीएनएस और परिधि में वास्तविक समय में सीडी 19 + बी कोशिकाओं जैसे विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं की निगरानी के लिए रणनीतियों की महत्वपूर्ण आवश्यकता है।

पीईटी इमेजिंग एक मजबूत इमेजिंग तकनीक है जो सीडी 19 जैसे किसी दिए गए लक्ष्य के विवो, पूरे शरीर के विज़ुअलाइज़ेशन में अनुमति देती है। जबकि रक्त खींचना, रिलैप्स दर के रिकॉर्ड, और एमआरआई के माध्यम से घाव की निगरानी उपचार प्रभावकारिता में स्नैपशॉट प्रदान करती है, पीईटी इमेजिंग शोधकर्ताओं और चिकित्सकों को पूरे शरीर में एक चिकित्सा की प्रभावशीलता की निगरानी करने की अनुमति दे सकती है। चिकित्सीय निगरानी के लिए यह सक्रिय दृष्टिकोण चिकित्सकों को वास्तविक समय में दवा प्रभावशीलता का आकलन करने की अनुमति देता है, जिससे आवश्यकतानुसार तेजी से समायोजन हो सकता है। रोग से जुड़े सेल आबादी के स्थान और घनत्व की निगरानी भी रोगी-विशिष्ट शारीरिक जानकारी का उपयोग करके गंभीरता के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन की अनुमति देती है। इस प्रकार नैदानिक और प्रीक्लिनिकल सेटिंग्स में पीईटी इमेजिंग की पूरी क्षमता का मज़बूती से उपयोग करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषणात्मक तरीकों को स्थापित करना आवश्यक है।

यह पेपर मानव सीडी 19 (एचसीडी 19) के प्रयोगात्मक ऑटोम्यून्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) माउस मॉडल में 64 क्यू-लेबल एंटी-ह्यूमन सीडी 19 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) के साथ सीडी 19 + बी कोशिकाओं के पीईटी इमेजिंग, एक्स विवो गामा गिनती और ऑटोरेडियोग्राफी (एआरजी) करने के तरीकों (चित्रा 1) का वर्णन करता है, जिसे 16सी4-टीएम (64क्यू-एचसीडी 19-एमएबी) के रूप में जाना जाता है।). हम मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में रेडियोट्रेसर बाइंडिंग का सटीक और पुन: मूल्यांकन करने के तरीके भी प्रदान करते हैं, रोगजनन के दोनों महत्वपूर्ण स्थल अक्सर इस और अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव मॉडल में गंभीर रूप से प्रभावित होते हैं। ये तकनीकरोग विकृति में बी कोशिकाओं की भूमिका की गैर-इनवेसिव जांच की अनुमति देती हैं और एमएस में एंटी-बी सेल थेरेपी की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए नैदानिक रूप से अनुवाद ति होने की क्षमता है।

Protocol

Figure 1
चित्र 1: अध्ययन डिजाइन। इस लेख में प्रमुख तकनीकों का अवलोकन। (ए) चूहों को उनकी पीठ पर स्कैनिंग बेड में रखने से रीढ़ की हड्डी में गति कम हो जाती है। (बी) चूहों की पीईटी / सीटी इमेजिंग। (सी) रीढ़ की हड्डी के स्तंभ को उजागर करने के लिए जानवर के पृष्ठीय पक्ष के नीचे एक चीरा लगाएं। (डी) रीढ़ की हड्डी के स्तंभ को ग्रीवा/वक्ष और काठ के भागों में विभाजित करें और पांच संकेतित कटों के बाद के खंडों को हटा दें। (ई) सिरिंज और रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के साथ एक सील बनाकर रीढ़ की हड्डी को रीढ़ की हड्डी से हटाने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें और रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के कपाल और पुच्छल सिरों से फ्लशिंग करें जैसा कि दिखाया गया है। (च) पृथक ग्रीवा/वक्ष और काठ की रीढ़ की हड्डी के खंड। संक्षिप्त नाम: पीईटी / सीटी = पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी / कंप्यूटेड टोमोग्राफी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सभी जानवरों के अध्ययन स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय में प्रयोगशाला पशु देखभाल (एपीएलएसी) पर प्रशासनिक पैनल के अनुसार किए गए थे, जो एसोसिएशन फॉर द असेसमेंट एंड एक्रेडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर (एएएलएसी इंटरनेशनल) द्वारा मान्यता प्राप्त कार्यक्रम है। चूहों पर तनाव को कम करने के लिए अध्ययन शुरू होने से कम से कम 7 दिनों पहले चूहों को विवेरियम के लिए अनुकूलित किया गया था, क्योंकि तनाव ईएई प्रेरण को प्रभावित कर सकता है।

1. महिला मानवकृत सीडी 19 चूहों में ईएई प्रेरण।

  1. ईएई के साथ 9-13 सप्ताह की आयु के मानवकृत सीडी 19 सी 57बीएल / 6 जे मादा चूहों को प्रेरित करें जैसा कि पहले एमओजी1-125 का उपयोग करकेवर्णित किया गया था।

2. ईएई माउस मॉडल में पशु देखभाल और स्कोरिंग

  1. स्कोर रोग की प्रगति और चूहों की देखभाल जैसा कि पहले वर्णित5. संक्षेप में, इस मॉडल को 1-5 के पैमाने पर निम्नानुसार स्कोर करें: 1 पूंछ की कमजोरी / लंगड़ापन है, 2 कमजोर हिंदलिम्ब है, 3 हिंदलिम्ब पक्षाघात है, 4 फोरलिम्ब कमजोरी के साथ हिंदलिम्ब पक्षाघात है, 5 मरणासन्न है।

3. एमएबी संयुग्मन, रेडियोलेबलिंग और लक्षण वर्णन।

  1. द्विक्रियाशील चेलेटर 1,4,7,10-टेट्राज़ासाइक्लोडोडेकेन-1,4,7,10-टेट्राएसिटिक एसिड मोनो-एन-हाइड्रॉक्सीसुक्सीनिमाइड एस्टर (डीओटीए-एनएचएस-एस्टर) को एचसीडी 19-एमएबी से 64क्यू के साथ रेडियोलेबल में संयुग्मित करें।
    1. एक डीसाल्टिंग कॉलम का उपयोग करके, एचईपीईएस बफर (पीएच 8.5-9) के साथ एचसीडी 19-एमएबी स्टोरेज बफर का आदान-प्रदान करें: एचईपीईएस के साथ डीसाल्टिंग कॉलम (ओं) को कंडीशन करें। डीसाल्टिंग कॉलम नमूना मात्रा क्षमता और आवश्यक एमएबी की मात्रा के आधार पर आवश्यक कॉलम की संख्या की गणना करें: 0.5 एमएल ट्यूब: नमूना मात्रा का 30-130 μL, 300 μL धोने; 2 एमएल ट्यूब: 200-700 μL नमूना मात्रा, 1 एमएल धोने।
    2. डीसाल्टिंग कॉलम के माध्यम से बफर एक्सचेंज के लिए सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    3. फ्रिज से डिसाल्टिंग कॉलम पुनर्प्राप्त करें। डिसाल्टिंग कॉलम के निचले भाग को हटा दें, कैप को ढीला करें, और कॉलम को एक संग्रह ट्यूब में रखें।
    4. भंडारण समाधान को हटाने के लिए 2 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज; भंडारण समाधान युक्त प्रवाह को छोड़ दें और संग्रह ट्यूब का पुन: उपयोग करें। स्तंभ पर एक रेखा चिह्नित करें जहां डीसाल्टिंग कॉम्पैक्ट राल का उच्चतम बिंदु ऊपर की ओर झुका हुआ है।
    5. डीसाल्टिंग कॉलम के निचले हिस्से में एचईपीईएस बफर जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज में डिसाल्टिंग कॉलम को बाहर की ओर की ओर रेखा के साथ रखें; 2 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर स्पिन करें। प्रवाह को छोड़ दें और संग्रह ट्यूब का पुन: उपयोग करें।
    6. एक ही संग्रह ट्यूब का उपयोग करके चरण 3.1.4 और 3.1.5 2x दोहराएं और चरणों के बीच प्रवाह को छोड़ दें।
    7. वातानुकूलित डिसाल्टिंग कॉलम को एक नई संग्रह ट्यूब और लेबल में रखें; इस ट्यूब में एचसीडी 19-एमएबी होगा।
    8. वातानुकूलित डीसाल्टिंग कॉलम (ओं) के शीर्ष पर एचसीडी 19-एमएबी जोड़ें और खाली एमएबी शीशी को कुल्ला करने के लिए एचईपीईएस बफर का उपयोग करें; इसे डीसाल्टिंग कॉलम के शीर्ष पर जोड़ें (निर्माता की सिफारिश के अनुसार कुल मात्रा)। एचसीडी 19-एमएबी को प्राप्त करने के लिए 2 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर स्पिन करें। प्रवाह को एचसीडी 19-एमएबी युक्त रखें।
    9. विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एचसीडी 19-एमएबी की एकाग्रता को मापें और यदि आवश्यक हो तो एचईपीईएस बफर के साथ 0.5 μg / μL में समायोजित करें।
    10. एचसीडी 19-एमएबी समाधान में, एचसीडी 19-एमएबी समाधान में ईडीटीए 0.01 एम की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 0.5 एम ईडीटीए के एमएबी समाधान की मात्रा का 1/50वां हिस्सा जोड़ें। एचसीडी 19-एमएबी-ईडीटीए समाधान को 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े रहने दें।
    11. फ्रीजर से डीओटीए-एनएचएस-एस्टर को हटा दें और इसे कमरे के तापमान (10-15 मिनट) पर आने दें। डीओटीए एकाग्रता बनाने के लिए डीओटीए-एनएचएस-एस्टर में जोड़ने के लिए डीएमएसओ की मात्रा की गणना करें जो वांछित डीओटीए / एमएबी मोलर अनुपात (जो आमतौर पर 1-2 डीओटीए / एमएबी के क्रम पर होता है) को जोड़ने की अनुमति देगा।
      नोट: एचसीडी 19-एमएबी में जोड़े गए डीएमएसओ-डीओटीए-एनएचएस-एस्टर की मात्रा एमएबी वॉल्यूम के 10% से अधिक नहीं होनी चाहिए। यह एक स्प्रेडशीट का उपयोग करके किया जाना चाहिए ताकि इसे जल्दी और बार-बार किया जा सके।
    12. डोटा से एचसीडी 19-एमएबी के वांछित अनुपात के आधार पर, एचसीडी 19-एमएबी में जोड़ने के लिए डीओटीए-एनएचएस-एस्टर की मात्रा की गणना करें।
      एनएमओएल एमएबी × 10 डीओटीए/एमएबी → एनएमओएल डीओटीए → मिलीग्राम डोटा → मिलीग्राम/एमएल डीओटीए/डीएमएसओ → एमएल डीएमएसओ समाधान के कमजोर पड़ने वाले कारक के → डीएमएसओ के 10 डीओटीए/एमएबी मिलीग्राम
    13. डीओटीए-एनएचएस-एस्टर के 1-2 मिलीग्राम वजन करें, और डीओटीए-एनएचएस-एस्टर में डीएमएसओ की सही मात्रा (चरण 3.1.11 में गणना) को सावधानीपूर्वक जोड़ें; मिक्स करें और नीचे घुमाएं।
    14. डीओटीए-एनएचएस-एस्टर समाधान (चरण 3.1.12) की गणना की गई मात्रा को एचसीडी 19-एमएबी समाधान में पिपेट; अतिरिक्त डीओटीए-एनएचएस-एस्टर को जोड़ने से पहले पिपेट टिप के बाहर पोंछ दें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि अतिरिक्त डीओटीए-एनएचएस-एस्टर नहीं जोड़ा गया है (पिपेट में मात्रा को बदलने के बिना)। धीरे से मिलाएं और नीचे घुमाएं।
    15. रात भर प्रतिक्रिया करने के लिए फ्रिज (4 डिग्री सेल्सियस) में रखें (12-16 घंटे)।
  2. शुद्धि और एकाग्रता
    1. केन्द्रापसारक संकेंद्रक बफर विनिमय चरणों के लिए सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें; संयुग्म को स्नैप-फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ पर एक धातु पीसीआर ट्यूब ब्लॉक रखें।
    2. फ्रिज से डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी प्रतिक्रिया को हटा दें और जैविक ग्रेड टीआरआईएस बफर जोड़कर बुझाएं: कुल प्रतिक्रिया मात्रा का 10%। मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए नमूने के 10-20 μg निकालें।
    3. 0.1 एम अमोनियम एसीटेट बफर, पीएच 5.5 का उपयोग करके ऊपर वर्णित (चरण 3.1.1-3.1.5) के रूप में डिसाल्टिंग कॉलम (ओं) को कंडीशन करें।
    4. बफर अमोनियम एसीटेट (चरण 3.1.1-3.1.8) के लिए डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी समाधान का आदान-प्रदान करता है।
    5. डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी समाधान पर ध्यान केंद्रित करें: मात्रा पर निर्माता की सिफारिशों के बाद 50 केडीए आणविक भार कट-ऑफ केन्द्रापसारक कंसंट्रेटर में समाधान जोड़ें। 10 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज (या जब तक मात्रा 80% -90% कम न हो जाए); प्रवाह को छोड़ दें।
    6. नौ और बार दोहराएं (कुल 10): वॉल्यूम को अधिकतम अनुशंसित मात्रा में वापस लाने के लिए पर्याप्त अमोनियम एसीटेट जोड़ें।
      नोट: कुल वह होना चाहिए जो शुरू में जोड़ा गया था, जिसमें कॉलम में क्या बचा है, आमतौर पर 500 μL क्षमता के केन्द्रापसारक कंसंट्रेटर के लिए 400-450 μL।
      1. किसी भी अवशिष्ट डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी को पुनः प्राप्त करने के लिए अमोनियम एसीटेट बफर के साथ प्रतिक्रिया शीशी को कुल्ला करें; केन्द्रापसारक कंसंट्रेटर में वॉश जोड़ें।
      2. 10 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
        नोट: यदि कम समय में मात्रा 80% -90% तक कम हो जाती है तो बाद के स्पिन पर स्पिन समय कम हो सकता है।
    7. केन्द्रापसारक कंसंट्रेटर से प्रोटीन समाधान निकालें। DOTA-hCD19-mAb की कुल मात्रा पर ध्यान दें।
      1. केन्द्रापसारक कंसंट्रेटर 2 में, मिश्रण करने के लिए 100 μL और पिपेट की कुल मात्रा के लिए पर्याप्त अमोनियम एसीटेट बफर जोड़ें। केन्द्रापसारक कंसंट्रेटर स्तंभ और इनवर्ट को कैप करें। घोल को इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए 4,000 × ग्राम पर स्पिन करें। एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      2. केन्द्रापसारक कंसंट्रेटर 500 में, केन्द्रापसारक सांद्रक से एमएबी समाधान एकत्र करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें; एक नई ट्यूब में जोड़ें।
    8. यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एकाग्रता को मापें। यदि एकाग्रता 2 मिलीग्राम / एमएल से अधिक है, तो अमोनियम एसीटेट के साथ 2 मिलीग्राम / एमएल तक पतला करें।
    9. एलिकोट 100 μg प्रति पीसीआर ट्यूब (लगभग 50 μL); ट्यूबों को डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी, दिनांक, द्रव्यमान और एकाग्रता के साथ लेबल करें। शीशियों को नीचे घुमाएं।
    10. सूखी बर्फ पर ठंडा पीसीआर ब्लॉक पर डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी को स्नैप-फ्रीज करें (या सूखी बर्फ पर फ्रीज करें)। एक बार जब सभी नमूने जमे हुए होते हैं, तो उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
    11. मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्रति एचसीडी 19-एमएबी डीओटीए की संख्या को मापें। अनुपात की गणना करने के लिए प्रत्येक संयुग्मन से असंयुग्मित (शुद्ध) एंटीबॉडी का एक नमूना रखें। नीचे दिए गए समीकरण (1) का उपयोग करें; आणविक भार को संक्षिप्त मेगावाट कहा जाता है।
      Equation 1(1)
  3. रेडियोलेबलिंग
    नोट: संस्थागत नियमों का पालन करते हुए रेडियोधर्मिता को संभालने के लिए उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें, जिसमें लैब कोट, दस्ताने, और एक व्यक्तिगत शरीर और रिंग डोसीमीटर शामिल हैं। रेडियोधर्मी संदूषण को रोकने के लिए नियमित रूप से दस्ताने का सर्वेक्षण करें और बदलें। लीड परिरक्षण का उपयोग करें और जब संभव हो तो चिमटे से संभालकर रेडियोधर्मी स्रोत से दूरी बढ़ाएं।
    1. एक पिपेट का उपयोग करके शिपिंग शीशी से रेडियोधर्मिता को एक नई शीशी में स्थानांतरित करें। रेडियोधर्मिता को मापें।
    2. पहली रेडियोलेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए एक एलिकोट निकालें। 64Cu-CuCl3 के 1 mCi प्रति 1 mCi में अमोनियम एसीटेट (pH 5.5) के 50 μL जोड़ें। 5 और 6 के बीच अंतर करने के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन के साथ 5.5 को पकड़ने वाली सीमा के साथ पीएच पट्टी पर 1 μL को पाइप करके पीएच को मापें।
    3. यदि pH 4-5.5 नहीं है, तो इसे 1 M NaOH या 0.1 M HCl का उपयोग करके बदलें। यदि pH 4 से कम है तो 1 M NaOH की छोटी मात्रा, 1-5 μL जोड़ें या यदि pH 5.5 से अधिक है जब तक कि सही pH नहीं पहुंच जाता, तब तक 0.1 M HCl जोड़ें। प्रत्येक जोड़ के साथ, अच्छी तरह से मिलाएं, नीचे घूमें, और ऊपर वर्णित पीएच को मापें। किसी भी समाधान के प्रत्येक जोड़ और हटाने पर ध्यान दें (पीएच की जांच करने के लिए) ताकि अंतिम मात्रा की गणना की जा सके।
    4. एक बार इष्टतम पीएच प्राप्त हो जाने के बाद, 64क्यू-क्यूसीएल3 के 1 एमसीआई प्रति 1 एमसीआई में डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी के 10 μg जोड़ें। धीरे से मिलाएं और संक्षेप में स्पिन करें।
    5. प्रतिक्रिया शीशी को थर्मोमिक्सर पर 37 डिग्री सेल्सियस और 400 चक्कर प्रति मिनट (आरपीएम) पर रखें।
    6. 30 मिनट के बाद, प्रतिक्रिया को बुझाएं: कुल प्रतिक्रिया मात्रा को 50 से विभाजित करें, और प्रतिक्रिया मिश्रण में 0.5 एम ईडीटीए की मात्रा जोड़ें।
    7. समाधान में बाध्य और मुक्त तांबे के प्रतिशत को मापने के लिए तत्काल पतली परत क्रोमैटोग्राफी (आईटीएलसी) का उपयोग करके लेबलिंग दक्षता निर्धारित करें।
      1. टीएलसी पेपर की 1 सेमी चौड़ी स्ट्रिप्स काटें। पट्टी के ऊपर और नीचे से 1 सेमी चिह्नित करें और 0.1 एम साइट्रिक एसिड के 1 सेमी से कम मोबाइल चरण के साथ एक ट्यूब (50 एमएल शंक्वाकार फ्लास्क) तैयार करें (ट्यूब में रखे जाने पर मोबाइल चरण का स्तर पट्टी पर 1 सेमी के निशान से नीचे होना चाहिए)।
      2. नीचे 1 सेमी चिह्न (विलायक सामने) पर पट्टी पर प्रतिक्रिया समाधान का पिपेट 1 μL और ट्यूब में पट्टी रखें। जब तक विलायक सामने शीर्ष 1 सेमी के निशान तक नहीं पहुंच जाता, तब तक देखें, पट्टी को हटा दें, और इसे प्लास्टिक की चादर के टुकड़े में लपेटें।
      3. पट्टी को प्लेटफ़ॉर्म पर रखें और इसे रेडियो-टीएलसी इमेजिंग स्कैनर के माध्यम से चलाएं। मूल और मुक्त 64क्यू पर रेडियोलेबल एमएबी की तलाश करें जो मोबाइल चरण के सामने यात्रा करता है (चित्रा 2)। यदि मुक्त तांबे का प्रतिशत 5% (95% लेबलिंग दक्षता) से कम है, तो जानवरों में इंजेक्शन के साथ आगे बढ़ें। यदि मुक्त तांबे का प्रतिशत 5% से अधिक है, तो शुद्धिकरण के साथ आगे बढ़ें।
        नोट: मुक्त तांबे का प्रतिशत आम तौर पर डीओटीए-एमएबी से 64क्यू, प्रतिक्रिया समय, पीएच और तापमान के अनुपात पर निर्भर करता है। लगातार परिणाम सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक नए एमएबी के लिए प्रत्येक उपयोगकर्ता द्वारा प्रतिक्रिया स्थितियों को अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  4. एक डिस्पोजेबल डीएनए ग्रेड गुरुत्वाकर्षण स्तंभ के माध्यम से शुद्धि।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक डिस्पोजेबल डीएनए ग्रेड गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ (डीसाल्टिंग / बफर एक्सचेंज कॉलम) की स्थिति बनाएं। पर्याप्त लीड परिरक्षण के पीछे एक रिंग स्टैंड या अन्य उपकरण पर डिस्पोजेबल डीएनए ग्रेड गुरुत्वाकर्षण स्तंभ रखें; सुनिश्चित करें कि उपकरण स्थिर और आसानी से चलने योग्य है। ट्यूब को स्तंभ के नीचे रखें।
    2. गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ राल पर कच्चे प्रतिक्रिया मिश्रण को पिपेट करें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी तरल राल में बह न जाएं। पूरे वॉल्यूम (क्रूड उत्पाद प्लस पीबीएस) को 500 μL तक लाने के लिए पर्याप्त पीबीएस है।
    3. कॉलम को 1-10 लेबल वाले 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों पर रखें। कॉलम में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब में पांच बूंदें इकट्ठा करें जब तक कि प्रवाह बंद न हो जाए।
      नोट: 10 से कम ट्यूबों की आवश्यकता हो सकती है।
    4. स्तंभ के निचले भाग को कैप करें और अवशिष्ट रेडियोधर्मिता को मापें। प्रवाह के साथ प्रत्येक शीशी को मापें। 50 μCi से अधिक वाली प्रत्येक शीशी के लिए, प्रत्येक अंश में प्रतिशत बंधे तांबे को मापने के लिए प्रति चरण 3.3.7 एक आईटीएलसी तैयार करें।
      नोट: पहले एक या दो अंशों में केवल मोबाइल चरण होगा; रेडियोलेबल एमएबी पहले होगा (आमतौर पर अंश 2 या 3 से 5 या 6 तक) और मुक्त 64क्यू अंतिम होगा (कुछ कॉलम से चिपके रहेंगे)। प्रतिशत बाध्य 64क्यू अंशों के बीच भिन्न हो सकता है।
    5. अंशों को 95% से अधिक बाइंडिंग (5% से कम मुक्त तांबा) के साथ मिलाएं; इंजेक्शन के लिए समाधान का उपयोग करें। यदि वांछित हो, तो रेडियोलेबलिंग5 की पुष्टि करने और दाढ़ गतिविधि की गणना करने के लिए आकार-बहिष्करण एचपीएलसी करें। यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर एकाग्रता को मापने के लिए एक एलिकोट बचाएं जब यह 10 आधे जीवन (127 घंटे या 5.3 दिन) क्षय हो गया है।

4. खुराक की तैयारी

नोट: खुराक को संभालने से पहले, उचित पीपीई पहनें, जिसमें लैब कोट, शरीर और उंगली के डोसीमीटर और दस्ताने शामिल हैं।

  1. पीईटी स्कैनिंग से 18-24 घंटे पहले 64क्यू-डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी इंजेक्ट करें, ताकि शरीर में रेडियोट्रेसर के पर्याप्त परिसंचरण की अनुमति मिल सके।
  2. लीड परिरक्षण के पीछे तुरंत 64Cu-DoTA-hCD19-mAb के साथ लीड कंटेनर रखें। संभावित संदूषण की निगरानी के लिए गीजर काउंटर चालू करें।
    नोट: रेडियोधर्मी सामग्री को संभालते समय अक्सर दस्ताने बदलें। तेजी से दस्ताने में बदलाव की सुविधा के लिए खुराक खींचते समय डबल-ग्लोविंग की सिफारिश की जाती है। हमेशा दूषित शार्प और कचरा निर्दिष्ट परिरक्षित कचरा क्षेत्र में रखें।
  3. 64Cu-DOTA-hCD19-mAb को कम बाइंड 1.5 एमएल प्लास्टिक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में उचित एकाग्रता तक पतला करें।
    नोट: 64Cu-DoTA-hCD19-mAb प्लास्टिक से बंध जाएगा यदि यह कम बंधन नहीं है; 64सीयू कांच से बंध जाएगा।
    1. रेडियोलिसिस को रोकने और लगातार खुराक खींचने को सरल बनाने के लिए रेडियोट्रेसर को खारा में पतला करें।
    2. यदि संभव हो तो 100 μL में 75 और 150 μCi के बीच प्रशासित करने के लिए खुराक तैयार करें। सुनिश्चित करें कि अधिकतम कुल इंजेक्शन की मात्रा माउस के शरीर के वजन के 10% से अधिक नहीं है।
  4. कम बाइंड प्लास्टिक ट्यूब से खुराक खींचने के लिए 500 μL (50 cc) इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि सिरिंज में कोई बुलबुले नहीं हैं क्योंकि इसे अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया जाएगा।
    1. संबंधित पशु संख्याओं के साथ सिरिंज को प्रीलेबल करें।
    2. डेटा विश्लेषण के लिए एक प्रयोगशाला नोटबुक में खुराक गतिविधि और समय रिकॉर्ड करें।
    3. संज्ञाहरण के तहत समय को कम करने के लिए जानवरों को कैथेटरीकृत करते ही इंजेक्शन के लिए खुराक तैयार रखें।
  5. खुराक तैयार होने के बाद, अंशांकन कारक उत्पन्न करने के लिए स्कैनिंग के लिए एक मानक (प्रेत) तैयार करें।
    1. पानी (या पीबीएस) में पतला गतिविधि के 50-75 μCi के साथ एक 15 mL शंक्वाकार ट्यूब भरें।
      नोट: समाधान का पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करें। मानक लेबलिंग से बचे हुए 64सीयू से मुक्त हो सकता है।
      1. मानक में गतिविधि की मात्रा को मापें और समय रिकॉर्ड करें।

5. कैनुलाशन और इंजेक्शन

नोट: रेडियोट्रेसर 6 के इंजेक्शन के लिए चूहों के अंतःशिरा प्रवेशनी के लिए पहले वर्णित तरीके6 देखें।

  1. रेडियोट्रेसर प्रशासन की तैयारी में 1.5-3% आइसोफ्लुरेन से भरे एक बॉक्स में चूहों को एनेस्थेटाइज करने से पहले खंड 2.1 में वर्णित रोग की गंभीरता के लिए चूहों का वजन और स्कोर करें।
    नोट: इन चूहों को बेंच टॉप पर इंजेक्ट किया जाएगा, न कि पीईटी स्कैनर पर जैसा कि पहले वर्णित है। इंजेक्शन के लिए कैथेटर को गोंद करने की कोई आवश्यकता नहीं है, क्योंकि चूहों को कैनुलाशन और इंजेक्शन के बीच स्थानांतरित नहीं किया जाएगा।
  2. एक बार जब एक माउस कैनुलाहो जाता है, तो कैथेटर के अंत में सुई डालें और धीरे-धीरे इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के बाद, कैथेटर के माध्यम से एक छोटे से खारा फ्लश के साथ पालन करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि पूरी खुराक इंजेक्ट की गई है।
    नोट: मात्रा कैथेटर की मृत मात्रा के लगभग बराबर होनी चाहिए, जो लेखकों द्वारा उपयोग किए जाने वाले कैथेटर के लिए 50 μL है।
    1. रेडियोट्रेसर के किसी भी ड्रिप को इकट्ठा करने के लिए प्रयोगशाला पोंछे के एक टुकड़े पर इंजेक्ट करें; अवशिष्ट खुराक को मापते समय इसे शामिल करें।
    2. एक प्रयोगशाला नोटबुक में इंजेक्शन का समय रिकॉर्ड करें।
  3. इंजेक्शन के तुरंत बाद कैनुला को हटा दें। अवशिष्ट खुराक निर्धारित करने के लिए खुराक कैलिब्रेटर का उपयोग करके कैनुला, खुराक सिरिंज और ऊतक को मापें जिसे माउस में इंजेक्ट नहीं किया गया था।
    1. गतिविधि और समय को लैब नोटबुक में रिकॉर्ड करें.
  4. चूहों को इंजेक्शन दिए जाने के बाद, उनके पिंजरों को पिंजरे कार्ड से लेबल करें जो दर्शाता है कि चूहे रेडियोधर्मी हैं। संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार पिंजरों को रिकॉर्ड और लॉग करें। फिर, चूहों को एक निर्दिष्ट रेडियोधर्मी होल्डिंग क्षेत्र में रखें।

6. पीईटी / सीटी इमेजिंग

  1. 64Cu-DOTA-hCD19-mAb के इंजेक्शन के 18-24 घंटे बाद पीईटी इमेजिंग करें। स्कैनिंग से पहले चूहों को तौलें और स्कोर करें।
    नोट: स्कैनर ऑपरेटिंग निर्देश उपयोग किए जा रहे स्कैनर पर निर्भर करते हैं।
    1. सुनिश्चित करें कि पीईटी / सीटी स्कैनर का एक्स-रे घटक गर्म हो गया है और अधिग्रहण के लिए तैयार है।
    2. कंप्यूटर पर PET स्कैनर अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें।
    3. अन्वेषक लॉगिन ड्रॉपडाउन मेनू से, उपयुक्त प्रयोगशाला जानकारी पर क्लिक करें।
    4. प्रोजेक्ट पृष्ठ पर, या तो कोई नया प्रोजेक्ट बनाएँ या ड्रॉपडाउन मेनू से किसी मौजूदा प्रोजेक्ट का चयन करें.
    5. जब प्रारंभिक प्रॉम्प्ट स्वचालित रूप से स्क्रीन पर दिखाई देता है, तो होम बेड पर क्लिक करें और घर पर बिस्तर की प्रतीक्षा करें। फिर, वार्म अप सीटी पर क्लिक करें।
      1. सुनिश्चित करें कि सीटी परिरक्षण दरवाजा बंद है ताकि सीटी गर्म हो सके।
  2. जब स्कैनर गर्म हो रहा हो, तो ईएई चूहों को स्कोर करें और उन्हें हाइड्रेशन के लिए फ्लैंक में 0.2-0.4 एमएल गर्म खारा के साथ चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
  3. स्कैनर गर्म होने के बाद, अध्ययन के लिए पीईटी स्कैन सेट करने के लिए कंप्यूटर पर वापस जाएं।
    नोट: इन्हें स्कैन के दिन से पहले सेट किया जा सकता है।
    1. हाल के अध्ययन हेडर के तहत, नया अध्ययन बनाएं पर क्लिक करें। अध्ययन का नाम, प्रोटोकॉल, यौगिक और विषय की जानकारी भरें।
      1. यदि कोई PET/CT निष्पादित कर रहे हैं, तो पहले PET प्रोटोकॉल का चयन करें, और तब CT प्रोटोकॉल का चयन करें.
        नोट: आमतौर पर, ईएई माउस मॉडल को स्कैन करने के लिए एक मानक सीटी पर्याप्त है। एक सीटी स्कैन 1 मिनट लंबा होता है और वोल्टेज 80 केवीपी, वर्तमान 150 μA, और 720 अनुमानों पर 2 x 2 पर बिनिंग के साथ अधिग्रहित किया जाता है। सीटी छवियों को एक संशोधित फेल्डकैम्प एल्गोरिदम का उपयोग करके पुनर्निर्माण किया जाता है।
      2. पीईटी प्रोटोकॉल के लिए, 10-15 मिनट स्थैतिक 64-तांबा स्कैन चुनें। यदि यह स्कैन पहले से ही उपलब्ध प्रोटोकॉल की सूची में नहीं है, तो मानक मेनू में प्रोटोकॉल टैब पर क्लिक करके इसे जोड़ें, नया प्रोटोकॉल बनाएं | आइसोटोप ड्रॉपडाउन मेनू। यदि वांछित आइसोटोप सूचीबद्ध नहीं है, तो अधिक पर क्लिक करें | लाइब्रेरी से जोड़ें और वांछित आइसोटोप जोड़ें। स्कैन अवधि निर्धारित करें, स्टेटिक स्कैन के लिए रेडियो बटन पर क्लिक करें, प्रोटोकॉल को नाम दें और सहेजें पर क्लिक करें।
      3. अध्ययन टैब पर लौटें और दिन के लिए सभी वांछित स्कैन को नाम देना और सेट करना जारी रखें।
        नोट: इष्टतम प्लेसमेंट सुनिश्चित करने के लिए पहले स्कैन की बेड पोजिशनिंग की जांच करने के लिए केवल एक मानक सीटी का उपयोग करके एक "सीटी टेस्ट" स्कैन स्थापित करने की भी सिफारिश की जाती है। यह अध्ययन के लिए पहला स्कैन रन होना चाहिए।
  4. एक बार स्कैनर तैयार हो जाने के बाद, चूहों को स्कैन के लिए तैयार करने के लिए एक वध बॉक्स में एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: इस स्तर पर, चूहों की संभावना बहुत बीमार है; एनेस्थीसिया के तहत समय को कम करना सबसे अच्छा अभ्यास है।
    1. आई जेल लगाएं।
  5. सुनिश्चित करें कि चार-माउस स्कैनिंग बिस्तर हीटिंग तत्वों से लैस है, जैसे हीटिंग पैड या गर्म हवा, जिसमें आइसोफ्लुरेन 1.5% -2% पर सेट है और हीटिंग पैड चालू है (चित्रा 3)। स्कैनिंग बिस्तर पर चूहों को लापरवाह स्थिति में रखें।
    1. जैसे-जैसे ईएई रोग बढ़ता है, माउस की रीढ़ गंभीर रूप से घुमावदार हो जाती है। रीढ़ की हड्डी को जितना संभव हो उतना सीधा करने के लिए अपनी पीठ पर होने पर चूहों को स्कैन करें, जिससे नीचे की ओर विश्लेषण में सुधार हो। रीढ़ की हड्डी को सीधा करने में सहायता के लिए धीरे से माउस पूंछ खींचें।
  6. एक बार लापरवाह स्थिति में, प्रत्येक माउस को सुरक्षित रूप से नरम माइक्रोस्कोप टेप के साथ टेप करें। सांस लेने के कारण गति को कम करने के लिए सिर पर टेप की एक पट्टी का उपयोग करें और पेट पर धीरे से दूसरी पट्टी का उपयोग करें।
    1. एक प्रयोगशाला नोटबुक में रिकॉर्ड करें कि कौन सा माउस किस स्कैनिंग स्थिति में है।
  7. एक बार चूहों को सुरक्षित करने के बाद, स्कैनर को संचालित करने के लिए स्कैनिंग कंप्यूटर पर लौटें।
  8. गति नियंत्रक मेनू खोलें। स्कैनिंग बेड पर चूहों को पीईटी रिंग में ले जाने के लिए पीईटी सेंटर एफओवी पर क्लिक करें। दिन के पहले स्कैन के लिए, सीटी सेंटर एफओवी पर क्लिक करें। एक बार स्थिति में आने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए सीटी टेस्ट स्कैन चलाएं कि स्थिति सही है; बिस्तर की स्थिति संतोषजनक होने तक दोहराएं।
    1. अध्ययन के शेष भाग के लिए सही बिस्तर प्लेसमेंट को चिह्नित करने के लिए स्कैनिंग बिस्तर पर सफेद टेप का एक छोटा टुकड़ा रखें।
  9. एक बार पीईटी स्कैन के लिए बिस्तर होने के बाद, रन पर क्लिक करके स्कैनिंग अनुक्रम शुरू करें।
    1. स्कैनर के स्वचालित रूप से पीईटी रिंग से सीटी में स्थानांतरित होने की प्रतीक्षा करें।
    2. हमेशा नेत्रहीन जांचें कि जानवर पीईटी और सीटी दोनों के लिए उचित स्थिति में चले गए हैं या नहीं।
    3. डेटा विश्लेषण के दौरान इंजेक्ट की गई खुराक के क्षय सुधार के लिए एक लैब नोटबुक में स्कैन प्रारंभ समय रिकॉर्ड करें।
  10. स्कैन पूरा होने के बाद, छवि को पुनर्निर्माण करने की अनुमति दें। जानवरों को हटाने से पहले डेटा की जांच करें।
    नोट: 3 डी-ऑर्डर किए गए उपसमुच्चय अपेक्षा-अधिकतमकरण (ओएसईएम) पुनर्निर्माण में एक स्थिर स्कैन के लिए लगभग 5 मिनट लगेंगे।
  11. नेत्रहीन रूप से डेटा की जांच करें और अनुमोदित करें, प्लीहा को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें क्योंकि इस ऊतक में बड़ी संख्या में बी कोशिकाएं होती हैं। स्कैनिंग बिस्तर से जानवरों को हटा दें और छिड़काव और बाद के विच्छेदन की तैयारी में उन्हें आइसोफ्लुरेन से भरे वध बॉक्स में रखें।
  12. अध्ययन में शेष चूहों के लिए चरण 6.5-6.12 दोहराएं।
  13. जब सभी चूहों को स्कैन किया जाता है या स्कैनिंग बेड में खुली जगह वाले समूह को स्कैन करते समय, चरण 4.6 में तैयार मानक को स्कैन करें।

7. पूर्व विवो गामा गिनती और ऑटोरेडियोग्राफी के लिए विच्छेदन।

  1. विच्छेदन से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी गामा गिनती और सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को पूर्व-तौला गया है।
  2. पीबीएस और थोराकोटॉमी के साथ छिड़काव के माध्यम से इच्छामृत्यु करें, जैसा कि पहले वर्णित6 है, जबकि चूहों को गहराई से एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है (4% आइसोफ्लुरेन की लगातार साँस लेना, 2 एल / मिनट 100% ओ2)।
  3. अस्थि मज्जा को हटाने के लिए, घुटने और श्रोणि पर दोनों फीमर काट लें। सुनिश्चित करें कि दोनों सिर फीमर से हटा दिए गए हैं।
    1. दोनों फीमर को 0.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें नीचे एक छेद होता है (20 ग्राम सुई का उपयोग करके) और ढक्कन काट दिया जाता है।
    2. फीमर युक्त 0.5 एमएल ट्यूब को ढक्कन के साथ 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के अंदर रखें।
    3. पूरे ट्यूब सेटअप को एक मिनी सेंट्रीफ्यूज में रखें। 4,500 × ग्राम पर 4 मिनट के लिए स्पिन करें।
      नोट: अस्थि मज्जा को 0.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में छेद के माध्यम से हटा दिया जाना चाहिए और 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल पर बसना चाहिए।
      1. ट्यूबों को अलग करें। 0.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में खाली फीमर का वजन करें। 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में अस्थि मज्जा का वजन करें। प्रत्येक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को गामा गिनती ट्यूबों में रखें।
  4. ब्रेनस्टेम को बरकरार रखने का ध्यान रखते हुए, बल और कैंची का उपयोग करके मस्तिष्क को हटा दें। मस्तिष्क को गामा काउंटिंग ट्यूब में रखें। सूखे वजन को रिकॉर्ड करें, पीबीएस के साथ फ्लश करें, और गिनती के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
  5. रीढ़ की हड्डी को हटाने के लिए, निम्न चरणों का पालन करें।
    1. रीढ़ की हड्डी के स्तंभ को उजागर करने के लिए जानवर के पृष्ठीय पक्ष के नीचे चीरा लगाकर त्वचा और फर को हटा दें (चित्रा 1)।
    2. रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के चारों ओर और उसके माध्यम से तीन अनुप्रस्थ विमानों के साथ काटकर गर्भाशय ग्रीवा (सी) और वक्ष क्षेत्रों से काठ (एल) को अलग करें: गर्दन के आधार पर (सी 1 कशेरुक) (चित्रा 1 डी, संख्या 1); रिबकेज के आधार पर (एल 1 कशेरुक) (चित्रा 1 डी, संख्या 2); श्रोणि के आधार पर (एल 5 कशेरुक) (चित्रा 1 डी, संख्या 3)।
    3. पसली पिंजरे के नीचे काट लें (चित्र 1 डी, संख्या 2)।
    4. काठ की रीढ़ की हड्डी के क्षेत्र को अलग करने के लिए सीधे थैली के ऊपर काटें। रीढ़ की हड्डी को श्रोणि छोर से सावधानीपूर्वक ट्रिम करें जब तक कि काठ की रीढ़ की हड्डी दिखाई न दे (चित्रा 1 डी, संख्या 3)। रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के काठ और ग्रीवा / वक्ष क्षेत्रों को अलग करने के लिए आसपास के ऊतकों को ट्रिम करें (चित्रा 1 डी, संख्या 4 और 5)।
    5. रीढ़ की हड्डी को निष्कासित करने के लिए, पीबीएस से भरे स्लिप-टिप सिरिंज (3-10 एमएल) का उपयोग करें। अंगूठे और फोरफिंगर का उपयोग करके सिरिंज और रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के बीच एक सील बनाएं।
      1. रीढ़ की हड्डी को शोषक पैड पर निष्कासित करने के लिए धीरे से पीबीएस को सिरिंज के माध्यम से धक्का दें (चित्रा 1 ई); दोनों रीढ़ की हड्डी के क्षेत्रों के लिए दोहराएं। रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को गामा गिनती ट्यूब में रखें।
      2. सूखे वजन को रिकॉर्ड करें, और यह सुनिश्चित करने के लिए पीबीएस जोड़ें कि ऊतक सूखने से बचने के लिए ट्यूब के निचले हिस्से में है। गिनती के लिए तैयार होने तक ट्यूब को बर्फ पर रखें।
      3. वक्ष यी रीढ़ की हड्डी को कपाल के छोर से और रीढ़ की हड्डी को रीढ़ की हड्डी को रीढ़ की हड्डी के पुच्छल छोर से निष्कासित करें (चित्र 1 ई)।

8. पूर्व विवो गामा गिनती।

  1. गामा काउंटर सॉफ़्टवेयर खोलें। कार्य सूची पर नेविगेट करें और वांछित प्रोटोकॉल का चयन करें, जैसे कि 64Cu के लिए 30 s काउंटिंग प्रोटोकॉल।
  2. अलग-अलग ट्यूबों में कम से कम तीन मानक तैयार करें। विश्लेषण में उपयोग के लिए उन्हें अभी चलाएं (चरण 10.2)। तीन अलग-अलग ट्यूबों में तीन प्रतिकृति वॉल्यूम और गतिविधि की मात्रा बनाने का लक्ष्य रखें।
    नोट: 500 μL की मात्रा अच्छे परिणाम देती है। जबकि गतिविधि उपयोग की गई मशीन द्वारा निर्धारित की जाएगी, 10 μCi आम तौर पर अच्छी तरह से काम करता है।
  3. मानकों को चलाने के लिए वांछित प्रोटोकॉल के अनुरूप बारकोड के साथ लेबल किए गए रैक में रखें। गामा काउंटर पर रैक रखें।
  4. अंग भार रिकॉर्ड करने के बाद, मानकों वाले ट्यूबों के बाद गामा गिनती रैक पर अंगों वाले ट्यूबों को रखें।
    नोट: इस मॉडल के लिए रुचि के अंगों में अक्षीय लिम्फ नोड्स, रक्त, अस्थि मज्जा, मस्तिष्क, ग्रीवा लिम्फ नोड्स, फीमर, हृदय, यकृत, काठ की रीढ़ की हड्डी, मांसपेशियों, प्लीहा, पूंछ और ग्रीवा / वक्ष रीढ़ की हड्डी शामिल हो सकते हैं।
  5. गामा काउंटर के पीछे स्टॉप बारकोड के साथ एक रैक रखें।
  6. कंप्यूटर पर प्ले बटन दबाएँ। यदि संभव हो, तो प्ले को तब तक न दबाएं, जब तक कि सभी ट्यूबों को एक फ़ाइल में लगातार गिने जाने की अनुमति देने के लिए कई रैक या अंग न हों। सुनिश्चित करें कि स्टॉप बारकोड वाला एक रैक प्रत्येक रन के लिए गामा काउंटर के पीछे है।
  7. तब तक चलाएं जब तक कि सभी नमूने गिने नहीं जाते। फ़ाइल सहेजें और निर्यात करें.

9. सीएनएस ऊतक का पूर्व विवो ऑटोरेडियोग्राफी (एआरजी)

  1. मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी एआरजी दोनों के लिए पहले प्रकाशित चरणों का पालन करें (जबकि चेनी एट अल द्वारा वर्णित चरण 2-6 को छोड़कर, क्योंकि चूहों को पहले से ही पीईटी स्कैन से रेडियोट्रेसर के साथ इंजेक्ट किया जाता है)6।
    नोट: रीढ़ की हड्डी एआरजी कैसेट तैयार करने के लिए विशिष्टनिर्देश यहां सूचीबद्ध हैं।
  2. काठ और गर्भाशय ग्रीवा / वक्ष रीढ़ की हड्डी के लिए गामा गिनती पूरी होने के बाद, तुरंत ट्यूबों को बर्फ पर रखें जब तक कि सभी सीएनएस ऊतकों की गणना न की जाए।
    नोट: मस्तिष्क6 के एआरजी के लिए पहले प्रकाशित विधि देखें।
  3. रीढ़ की हड्डी को एक शोषक पैड पर गिरने की अनुमति देने के लिए ट्यूबों को धीरे से टिप दें। यदि रीढ़ की हड्डी ट्यूब के किनारे चिपक जाती है, तो धीरे से ठंडे पीबीएस के साथ फ्लश करें और ट्यूब को फिर से टिप दें। प्रयोगशाला ऊतक के साथ धीरे से सोखकर प्रत्येक रीढ़ की हड्डी को सावधानीपूर्वक सुखाएं। सूखे रीढ़ की हड्डी को कागज के मोटे काले टुकड़े पर एक संगठित तरीके से रखें।
    1. आसान पहचान के लिए एक सफेद पेन के साथ रीढ़ की हड्डी के बगल में लेबल करें।
    2. एआरजी कैसेट बंद होने पर रीढ़ की हड्डी के संपीड़न को रोकने के लिए स्पेसर के रूप में कार्य करने के लिए तीन माइक्रोस्कोप स्लाइड के ढेर रखने के लिए कोनों पर और काले कागज के बीच में जगह छोड़ दें। 5-7 ढेर का उपयोग करें।
  4. एक बार जब सभी काठ और गर्भाशय ग्रीवा / वक्ष रीढ़ की हड्डी को काले कागज पर रखा जाता है और लेबल किया जाता है, तो एआरजी कैसेट में कागज के टुकड़े को ध्यान से रखें। रीढ़ की हड्डी को फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ की ट्रे पर खुली कैसेट रखें।
  5. एक बार जमे हुए, धीरे से डिजिटल फॉस्फोर स्टोरेज स्क्रीन और रीढ़ की हड्डी के बीच प्लास्टिक की चादर रखें और स्क्रीन को नमूने के शीर्ष पर रखें। तुरंत कैसेट को बंद करें और इसे लगभग 10 आधे जीवन (~ 127 घंटे) के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें।
  6. जब एक्सपोज़र समय पूरा हो जाता है, तो फॉस्फोर इमेजर का उपयोग करके फिल्म को स्कैन करें। परिणामी डिजिटल छवि का विश्लेषण करें (निर्देशों के लिए अनुभाग 12 देखें)।

10. जैव वितरण डेटा का विश्लेषण

  1. रेडियोधर्मी क्षय के लिए समय सुधार को गणितीय रूप से निर्धारित करने के लिए एक "खुराक सुधार" स्प्रेडशीट सेट करें, इस प्रकार विकिरण खुराक को सामान्य करें और विषयों के बीच तुलना की अनुमति दें।
    1. इंजेक्शन के समय के लिए सभी खुराक को क्षय-सही करें, इंजेक्शन के बाद सिरिंज और कैथेटर में छोड़ी गई अवशिष्ट गतिविधि के लिए लेखांकन।
    2. चरण 8.2 में तैयार किए गए मानकों का उपयोग करके, गतिविधि राशि (μCi) और सामान्यीकृत गणना प्रति मिनट (CPM) औसत करें। CPM/μCi प्राप्त करने के लिए औसत CPM को औसत मानक गतिविधि राशि से विभाजित करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि प्रत्येक मानक के लिए गतिविधि राशि क्षय-सही है जब गामा काउंटर मानकों के सीपीएम की गणना करता है। गामा काउंटर को प्रोटोकॉल के प्रारंभ समय में सभी सीपीएम मानों को सामान्य करना चाहिए।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए ऊतक के प्रति ग्राम (% ID/g) अंतिम प्रतिशत इंजेक्शन खुराक की गणना करने के लिए "परिणाम" स्प्रेडशीट सेट करें।
    1. पशु के इंजेक्शन समय में गिने गए प्रत्येक नमूने के लिए गामा काउंटर से सामान्यीकृत सीपीएम को क्षय-सही करें।
      नोट: क्षय सुधार किसी भी समय बिंदु पर हो सकता है; सुनिश्चित करें कि सभी खुराक और सीपीएम मान एक ही समय बिंदु पर क्षय-सही हैं।
    2. प्रति नमूना सीपीएम निर्धारित करने के लिए क्षय-सही सीपीएम को प्रत्येक नमूने के द्रव्यमान पर सामान्य करें। गणना किए गए इंजेक्शन सीपीएम से पूंछ में सीपीएम को घटाकर इंजेक्शन दिए गए कुल सीपीएम की गणना करें।
      नोट: पूंछ को बड़े पैमाने पर ठीक करने की आवश्यकता नहीं है क्योंकि इस सीपीएम मान को इंजेक्शन से किसी भी अतिरिक्त ट्रेसर के लिए कुल इंजेक्शन सीपीएम से घटाया जाएगा।
    3. %ID/g की गणना करने के लिए इंजेक्ट किए गए कुल CPM से CPM को प्रति द्रव्यमान विभाजित करें।
  3. ग्राफ़िंग सॉफ़्टवेयर में इनपुट के लिए अंतिम परिणाम प्रदर्शित करने और बाद में डेटा विज़ुअलाइज़ेशन और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए "सारांश" स्प्रेडशीट सेट करें।

11. पीईटी छवि विश्लेषण

  1. पीईटी विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें। फ़ाइल पर चाटना |स्थानीय डेटा खोलें | DICOM. वांछित फ़ाइल (DICOM स्वरूप) की स्थिति जानें। पीईटी और सीटी दोनों खोलें।
  2. डेटा प्रबंधक में, पीईटी और सीटी कंट्रास्ट को वांछित स्तरों पर समायोजित करें।
  3. अलग-अलग चूहों को रजिस्टर करें और क्रॉप करें।
    1. नेविगेशन मेनू में, पुन: अभिविन्यास/पंजीकरण टैब का चयन करें.
    2. इस टैब के भीतर रिजिड मेनू पर जाएं। सीटी स्कैन (0) को फिक्स्ड स्कैन के रूप में और पीईटी स्कैन (1) को मूविंग स्कैन के रूप में नामित करें।
    3. कठोर परिवर्तन और तेज़ गुणवत्ता का चयन करें। रजिस्टर पर क्लिक करें।
    4. पंजीकरण पूरा होने के बाद (5-10 मिनट), पंजीकरण को सहेजने के लिए चेक मार्क पर क्लिक करें।
    5. पंजीकरण सफल रहा यह सुनिश्चित करने के लिए डेटा का नेत्रहीन निरीक्षण करें। फ़ाइल पर क्लिक करके सत्र निर्यात करें | सत्र | निर्यात करें.
    6. इसके बाद, प्रत्येक माउस को एक पूर्ण शरीर की फसल में क्रॉप करें: नेविगेशन मेनू पर जाएं और क्रॉपिंग पर क्लिक करें। प्रत्येक क्रॉस सेक्शन के किनारों को बाहरी किनारे से अंदर की ओर खींचें।
    7. एक बार वांछित माउस को कसकर क्रॉप करने के बाद, चेक मार्क पर क्लिक करें, और सहेजने के लिए सत्र निर्यात करें।
    8. इसके बाद, पंजीकरण / पुन: अभिविन्यास मेनू में मैनुअल अनुवाद, रोटेशन और फ्लिप का उपयोग करके मस्तिष्क विश्लेषण के लिए प्रत्येक माउस के सिर को क्रॉप और सीधा करें। बचाने के लिए निर्यात करें.
  4. रीढ़ की हड्डी का विश्लेषण करें।
    1. रीढ़ की हड्डी में रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) का विश्लेषण शुरू करने के लिए, नेविगेशन मेनू से 3 डी आरओआई टूल खोलें।
    2. आरओआई हेडर के तहत, छह आरओआई बनाने के लिए मेनू के निचले भाग में प्लस चिह्न का उपयोग करें: लम्बर आरओआई, सर्वाइकल / थोरेसिक आरओआई, लम्बर कंकाल, थोरेसिक कंकाल, काठ रीढ़ की हड्डी, थोरेसिक रीढ़ की हड्डी।
      नोट: काठ और ग्रीवा / थोरैसिक आरओआई सामान्यीकृत बड़े आरओआई हैं जिनका उपयोग कंकाल आरओआई बनाने के लिए किया जाएगा (चित्रा 4)।
    3. इस चरण के साथ पीईटी सिग्नल से दृश्य हस्तक्षेप से बचने के लिए, पीईटी को बंद करने के लिए एफ 3 पर क्लिक करें।
    4. 3 डी आरओआई टूल ऑपरेटर के शीर्ष पर जाएं। 3 डी पेंट मोड और इरोड / पतला मेनू खोलने के लिए कर्सर प्रतीक के दाईं ओर ठोस बिंदु पर क्लिक करें।
    5. गोले का चयन करें और आकार को 20 पिक्सेल में बदलें। +5 पर पतला करें।
      1. आगे बढ़ने से पहले, मेनू के नीचे जाएं। सुनिश्चित करें कि काठ आरओआई का चयन किया गया है, क्योंकि यह खींचा जाने वाला पहला आरओआई है।
    6. सीटी पर, रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के एल 6 कशेरुक (जहां रीढ़ कूल्हों से मिलती है) का पता लगाएं। एल 6 के ऊपर एक कशेरुक से शुरू करते हुए, कूल्हों (एल 1-एल 5 कशेरुका) के ऊपर पांच कशेरुकाओं पर एक मोटा आरओआई लम्बर आरओआई खींचें। फिर, ग्रीवा / थोरैसिक आरओआई पर स्विच करें और खोपड़ी के आधार पर रीढ़ के शेष हिस्से का पता लगाएं।
      नोट: यह सटीक नहीं होना चाहिए, क्योंकि इसका उपयोग यह इंगित करने के लिए किया जाता है कि चरण 11.4.8 में ओत्सु थ्रेशोल्डिंग कहां होनी चाहिए।
    7. सामान्यीकृत आरओआई खींचने के बाद, ऑपरेटर के शीर्ष पर जाएं। विभाजन एल्गोरिदम मेनू का चयन करें।
    8. ड्रॉपडाउन मेनू से, ओत्सु थ्रेशोल्डिंग का चयन करें। इनपुट के लिए, काठ ROI का चयन करें। मेनू के निचले भाग में, सुनिश्चित करें कि काठ कंकाल का चयन किया गया है। छवि के बगल में ड्रॉपडाउन मेनू में, सुनिश्चित करें कि सीटी स्कैन चुना गया है और लागू करें पर क्लिक करें। थोरेसिक आरओआई और थोरेसिक कंकाल के लिए दोहराएं।
      1. यदि ओत्सु थ्रेशोल्डिंग रीढ़ की हड्डी के स्तंभ को पर्याप्त रूप से उजागर नहीं करता है, तो ग्लोबल थ्रेशोल्डिंग का उपयोग करें और मैन्युअल थ्रेशोल्डिंग के लिए न्यूनतम मान को 350 और अधिकतम को 3,500 में बदलें और कशेरुक को अलग करने के लिए आवश्यकतानुसार समायोजित करें।
    9. कंकाल आरओआई बनाने के लिए ओत्सु थ्रेशोल्डिंग का उपयोग करने के बाद, नेविगेशन मेनू (कर्सर आइकन) पर लौटें। या तो उन्हें छिपाने के लिए खुरदरे काठ और गर्भाशय ग्रीवा / थोरैसिक आरओआई दोनों के लिए एच (छिपाना) कॉलम हटा दें या चेकमार्क करें। दोनों कंकाल आरओआई के लिए आई (अपरिवर्तनीय) कॉलम को चेकमार्क करें ताकि उन्हें संपादित न किया जा सके।
    10. अंत में, 3 डी आरओआई टूल ऑपरेटर के शीर्ष पर लौटें और स्पाइनल कॉर्ड आरओआई खींचने के लिए 3 डी पेंट मेनू पर जाएं।
      1. फिर से क्षेत्र उपकरण का चयन करें और काठ और वक्ष दोनों के लिए कंकाल के भीतर रीढ़ की हड्डी का पता लगाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि मेनू के निचले भाग में सही आरओआई का चयन किया गया है।
      2. किसी भी ROI को मिटाने के लिए, कमांड / कंट्रोल पर क्लिक करें और मिटाए जाने वाले हिस्से पर आकर्षित करें।
      3. यह सुनिश्चित करने के लिए सभी तीन विमानों से रीढ़ की हड्डी आरओआई की जांच करें कि रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के बाहर कोई आरओआई नहीं खींचा गया है।
  5. निर्यात रीढ़ की हड्डी विश्लेषण परिणाम।
    1. यदि पीईटी सिग्नल चरण 11.4.3 में बंद कर दिया गया था, तो पीईटी को वापस चालू करने के लिए स्पाइनल कॉर्ड आरओआई तैयार होने के बाद एफ 3 दबाएं, या दृश्य नियंत्रक (वीसी) का चयन करें और पीईटी बार पर क्लिक करें।
    2. नेविगेशन मेनू (कर्सर आइकन) पर वापस जाएं। तालिका दिखाने के लिए ग्रिड आइकन पर क्लिक करें। तालिका को स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में कॉपी करें और सहेजें।
    3. अंत में, आरओआई को सहेजने के लिए, जैसा कि ऊपर वर्णित है, पीईटी विश्लेषण सॉफ्टवेयर में फ़ाइल निर्यात करें।
  6. अर्ध-स्वचालित 3 डी एटलस का उपयोग करके मस्तिष्क का विश्लेषण करें।
    1. हेड क्रॉप फ़ाइल खोलें। उन्नत मॉड्यूल मेनू पर जाकर और 3 डी मस्तिष्क एटलस टूल का चयन करके माउस मस्तिष्क एटलस आयात करें। सुनिश्चित करें कि संदर्भ सीटी पर सेट है और फसल विकल्प अनियंत्रित है। आउटपुट निर्देशिका के लिए एक मार्ग सेट करें।
    2. उन्नत सेटिंग में, Versor-Affine में ट्रांसफ़ॉर्म बदलें. अन्य सभी डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखें. रन पर क्लिक करें।
    3. पंजीकरण मेनू में एटलस को मैन्युअल रूप से समायोजित करें और एटलस को फिट करने के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में खोपड़ी के सीटी का उपयोग करें।
      1. यदि स्केलिंग आवश्यक है तो बहुत सावधानी बरतें, क्योंकि यह मस्तिष्क संरचना की मात्रा को बहुत प्रभावित कर सकता है। समायोजन पूरा होने पर चेकमार्क पर क्लिक करें।
      2. चयनित आयात 3D ROI के साथ एटलस को पुन: चलाएँ.
      3. क्रॉप्ड हेड पर फिट किए गए एटलस को सहेजने के लिए फ़ाइल निर्यात करें।
    4. वांछित अंगों से सभी आरओआई खींचने और निर्यात करने के बाद, एक मानक बाध्यकारी सुधार मूल्य की गणना करें। क्षय-सही सभी डेटा और %ID/g में कनवर्ट करें जैसा कि पहले वर्णित6. उस अंग को सामान्य करें जो पशु मॉडल के अनुरूप है, जैसे कि रक्त पूल में मौजूद रेडियोट्रेसर को सामान्य करने के लिए दिल।

12. पूर्व विवो ऑटोरेडियोग्राफी विश्लेषण।

  1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर डिजिटल छवि फ़ाइल (.gel) खोलें। वांछित सीमा के लिए चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें। यदि वांछित हो तो एक उपयुक्त रंग लुकअप टेबल लागू करें।
    नोट: विज़ुअलाइज़ेशन में आसानी के लिए रॉयल या ग्रे की सिफारिश की जाती है।

Representative Results

एचसीडी 19-एमएबी डीओटीए-संयुग्मित था और 64क्यू के साथ रेडियोलेबल किया गया था जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। ईएई और भोले चूहों को 64क्यू-डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी के साथ इंजेक्शन के 18-24 घंटे बाद पीईटी / सीटी स्कैनिंग (चित्रा 3) से गुजरना पड़ा। पीईटी / सीटी छवियों को पीईटी विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सह-पंजीकृत किया गया था, और सीएनएस ऊतकों का विश्लेषण मैनुअल आरओआई या अर्ध-स्वचालित 3 डी मस्तिष्क एटलस का उपयोग करके किया गया था। आरओआई में रेडियोट्रेसर बाइंडिंग (चित्रा 4) भोले चूहों की तुलना में ईएई चूहों में अधिक था। पूर्व विवो गामा गिनती और एआरजी ने भोले की तुलना में ईएई चूहों की रीढ़ की हड्डी (काठ और ग्रीवा वक्ष खंड दोनों) और मस्तिष्क (एआरजी केवल) में बंधन में वृद्धि देखी (चित्रा 5 और चित्रा 6)। संक्रमित चूहों की पूर्व विवो गामा गिनती ने परिधीय अंगों में रेडियोट्रेसर बाइंडिंग में कमी देखी, जिसमें प्लीहा, फीमर और अस्थि मज्जा (चित्रा 5) शामिल हैं, जो परिधि छोड़ने वाली बी कोशिकाओं के अनुरूप हैं और इस ईएई मॉडल में सीएनएस में घुसपैठ करते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: गुणवत्ता नियंत्रण डेटा के अलावा, 64 क्यू-लेबल मानव-विशिष्ट सीडी 19 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, 16 सी 4-टीएम एमएबी (64 क्यू-डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी) उत्पन्न करने के लिए संयुग्मन और रेडियोलेबलिंग योजना। (क) एचसीडी19-डोटा संयुग्म (स्केल नहीं) का उत्पादन करने के लिए एचसीडी19 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ डीओटीए-एनएचएस-एस्टर की अभिक्रिया और 64क्यू-डीओटीए-एचसीडी19-एमएबी का उत्पादन करने के लिए 64क्यू-क्यूसीएल3 के साथ रेडियोलेबलिंग। (बी) प्रतिनिधि आईटीएलसी क्रोमैटोग्राफ। 40-60 सेमी पर शिखर रेडियोलेबल एंटीबॉडी है; अनबाउंड 64क्यू-क्यूसीएल3 मोबाइल चरण के साथ यात्रा करता है और 200 से 240 सेमी तक मौजूद होगा। इस क्रोमैटोग्राफ में कोई पता लगाने योग्य मुक्त 64क्यू-क्यूसीएल3 नहीं है। (सी) रेडियोलेबल एंटीबॉडी के गुणवत्ता नियंत्रण विनिर्देश। संक्षेप: डीओटीए-एनएचएस एस्टर = 1,4,7,10-टेट्राज़ासाइक्लोडोडेकेन-1,4,7,10-टेट्राएसिटिक एसिड मोनो-एन-हाइड्रॉक्सीसुक्सीनिमाइड एस्टर; आईटीएलसी / एचपीएलसी = तत्काल पतली परत क्रोमैटोग्राफी / उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी; माल्डी/एलसी-एमएस = मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर प्रदूषक/आयनीकरण/तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री; सीपीएम = प्रति मिनट गिनती। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पीईटी स्कैनर के भीतर 3 डी-मुद्रित बिस्तर में चूहों को सुरक्षित करने के तरीके का प्रदर्शन करने वाली तस्वीरें गति को कम करते हुए रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क की उच्च गुणवत्ता वाली इमेजिंग को सक्षम करती हैं। (ए) हीटिंग तत्वों और संज्ञाहरण टयूबिंग से लैस 3 डी मुद्रित चार-माउस स्कैनर बिस्तर (जिसे "माउस होटल" भी कहा जाता है)। (बी) रीढ़ की सीधेपन को अधिकतम करने के लिए लापरवाह स्थिति में एनेस्थेटाइज्ड चूहे; प्रत्येक माउस की बिस्तर की स्थिति दर्ज की जाती है। (सी) चूहों ने सांस लेने से गति को कम करने के लिए मस्तिष्क और पेट में गति को कम करने के लिए अपने सिर पर सुरक्षित रूप से टैप किया, सांस लेने से गति को कम करने के लिए, श्वास को प्रभावित किए बिना। (डी) माउस बिस्तर स्कैनर के भीतर स्थित है और स्कैनिंग बिस्तर पर टैप किया गया है। एनेस्थीसिया टयूबिंग स्कैनर से बिस्तर तक और आइसोफ्लुरेन सेट 2% से जुड़ा हुआ था। स्कैनर दरवाजा बंद करने से पहले उचित आइसोफ्लुरेन स्तर सुनिश्चित करने के लिए माउस श्वास की निगरानी की गई थी। संक्षिप्त नाम: पीईटी = पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: रीढ़ की हड्डी की छवि और मस्तिष्क विश्लेषण और पीईटी विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके परिणाम । (ए) i) रीढ़ की हड्डी पर आरओआई (गुलाबी और टैन ) को वक्ष और ग्रीवा कशेरुक से काठ को अलग करने और ओत्सु थ्रेशोल्डिंग के लिए छवि तैयार करने के लिए खींचा जाता है। (ii ) रीढ़ की हड्डी (फ़िरोज़ा और लाल) को ओत्सु थ्रेशोल्डिंग का उपयोग करके विभाजित किया गया था। iii ) कशेरुकाओं को तब 3 डी आरओआई मेनू में अपरिवर्तनीय बनाया गया था, और रीढ़ की हड्डी को ग्रीवा / वक्ष (बैंगनी) और काठ (नौसेना) आरओआई में विभाजित किया गया था। iv) कशेरुक आरओआई को हटा दिया गया था, जिससे रीढ़ की हड्डी आरओआई और प्रतिनिधि मस्तिष्क एटलस लागू किया गया था। (बी) विभिन्न सीएनएस क्षेत्रों से पीईटी परिणामों का प्रतिनिधि विश्लेषण प्रत्येक जानवर के भीतर हृदय के आरओआई के लिए सामान्यीकृत %ID/g के रूप में दर्शाया गया है। पीईटी अधिग्रहण पीईटी / सीटी इमेजिंग के माध्यम से 10 मिनट का स्थैतिक स्कैन था। पैनल ए में दिखाए गए अर्ध-स्वचालित मस्तिष्क एटलस दृष्टिकोण का उपयोग करके मस्तिष्क क्षेत्रों की मात्रा निर्धारित की गई। iv) प्रतिनिधि परिणाम मस्तिष्क और वक्ष रीढ़ की हड्डी में ट्रेसर बाइंडिंग में महत्वपूर्ण वृद्धि की ओर महत्व या रुझान दिखाते हैं। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किए गए आंकड़े (*: पी < 0.0332)। संक्षेप: पीईटी = पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी; आरओआई = रुचि के क्षेत्र; सीएनएस = केंद्रीय तंत्रिका तंत्र; सीटी = कंप्यूटेड टोमोग्राफी; % ID/g = ऊतक के प्रति ग्राम प्रतिशत इंजेक्शन खुराक; ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ईएई और भोले चूहों में विभिन्न अंगों में एक्स विवो गामा गिनती का प्रतिनिधि परिमाणीकरण % आईडी / जी के रूप में व्यक्त किया गया है। पीईटी स्कैन के बाद, चूहों को रक्त में मौजूद रेडियोट्रेसर को हटाने के लिए पीबीएस के साथ संक्रमित किया गया था, या तो रक्त-निवासी सीडी 19 + बी कोशिकाओं से मुक्त या बंधे हुए थे, और प्रत्येक अंग के सटीक वजन के लिए अंगों को जल्दी से विच्छेदित और तौला गया था। भोले लोगों की तुलना में ईएई चूहों में प्लीहा और अस्थि मज्जा में ट्रेसर बाइंडिंग काफी कम हो जाती है। ईएई चूहों के काठ और गर्भाशय ग्रीवा / वक्ष रीढ़ की हड्डी दोनों खंडों में बढ़ी हुई रेडियोट्रैसर बाइंडिंग देखी जाती है। मस्तिष्क रेडियोट्रेसर सिग्नल में महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं दिखाता है, हालांकि यह महत्वपूर्ण वृद्धि की ओर बढ़ रहा है। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किए गए आंकड़े (*: पी < 0.0332; ****: पी < 0.0001)। संक्षेप: पीईटी = पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी; % ID/g = ऊतक के प्रति ग्राम प्रतिशत इंजेक्शन खुराक; ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: पूर्व विवो एआरजी छवियों में भोले चूहों की तुलना में ईएई से मस्तिष्क के वर्गों और पूरे रीढ़ की हड्डी में 64क्यू-डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी बाइंडिंग को दर्शाया गया है। डिजिटल फॉस्फोर स्टोरेज फिल्मों को लगभग 10 आधे जीवन (127 घंटे या 5 दिन) के लिए रेडियोधर्मी ऊतक के नमूनों के संपर्क में आने के बाद फॉस्फोर इमेजर का उपयोग करके स्कैन किया गया था। परिणामी छवियों से भोले चूहों से मस्तिष्क वर्गों की तुलना में ईएई चूहों के मस्तिष्क में नेत्रहीन उच्च संकेत प्रकट होते हैं, जो इस मॉडल5 में बी कोशिकाओं को शामिल करने के लिए ज्ञात क्षेत्रों के कारण अपेक्षित है। विशेष रूप से, ईएई माउस मस्तिष्क वर्गों के मस्तिष्क स्टेम, सेरिबैलम और वेंट्रिकल्स में ट्रेसर सिग्नल में वृद्धि हुई है। ईएई माउस मस्तिष्क वर्गों के लिए संकेत में यह वृद्धि ऊपर विस्तृत पूरे मस्तिष्क पीईटी परिमाणीकरण में क्या पाया गया था। इसी तरह, भोली रीढ़ की हड्डी की तुलना में गर्भाशय ग्रीवा / वक्ष और काठ रीढ़ की हड्डी दोनों खंडों में रेडियोट्रैसर बाइंडिंग में वृद्धि हुई है, जो पूर्व विवो गामा गिनती का उपयोग करके पाया गया था। संक्षेप: पीईटी = पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी; ईएई = प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस; वेंट = वेंट्रिकल्स; सीबी = सेरिबैलम; बीएस = मस्तिष्क स्टेम; टीएससी = वक्ष और ग्रीवा रीढ़ की हड्डी संयुक्त; एलएससी = काठ की रीढ़ की हड्डी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: सीडी 45 आर / बी 220 के साथ भोले और ईएई माउस मस्तिष्क ऊतक के सीएनएस ऊतकों का धुंधलापन। बी कोशिकाओं को ईएई चूहों के ब्रेनस्टेम, मेनिंगेस और सफेद पदार्थ में देखा जाता है (एन = 7 ईएई, एन = 5 भोले चूहों, प्रति जानवर औसत चार स्लाइस)। यह आंकड़ा 5 से है। स्केल बार = 5 मिमी (कम आवर्धन [1x]) मस्तिष्क की छवियों में, मस्तिष्क, मेनिंगेस और अनुमस्तिष्क सफेद पदार्थ में 100 μm (उच्च आवर्धन [20x])। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह आलेख CD19-PET का उपयोग कर MS के माउस मॉडल में मानव-CD19+ B कोशिकाओं की इमेजिंग के लिए एक सुव्यवस्थित विधि का वर्णन करता है। एमएस की विषम प्रस्तुति और उपचार के लिए अलग-अलग प्रतिक्रियाओं के कारण, क्लिनिक में इसका प्रबंधन चुनौतीपूर्ण हो सकता है और चिकित्सा चयन और निगरानी के लिए नए दृष्टिकोण की बहुत आवश्यकता है। पीईटी इमेजिंग रोग की प्रगति और बी सेल-क्षयकारी चिकित्सा के लिए व्यक्तिगत प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में काम कर सकती है। एमएस के अलावा, सीडी 19-पीईटी इमेजिंग का उपयोग लिम्फोमा और ल्यूकेमिया या अन्य बी सेल मध्यस्थता रोगों के उपप्रकारों में उपचार के बाद बी सेल की कमी की निगरानी के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि डेटा न्यूरोलॉजिकल रोगों में इमेजिंग बी कोशिकाओं की उपयोगिता दिखाते हैं।

एमएस के संदर्भ में मानव सीडी 19 + बी कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए, हमने बी सेल-निर्भर एमओजी1-125 ईएई मॉडल7 को चुना। अन्य ईएई मॉडल के समान, यह मॉडल प्रगतिशील पक्षाघात और सीएनएस में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की घुसपैठ के लक्षणों के साथ प्रस्तुत करता है। हालांकि, एमओजी1-125 मॉडल अद्वितीय है क्योंकि यह एक बी सेल-संचालित मॉडल है: चूहों में मेनिंगेस, मस्तिष्क स्टेम, पैरेन्काइमा और वेंट्रिकल्स में सबरैक्नॉइड स्पेस में बी कोशिकाओं की अलग-अलग संख्या होती है। ये लिम्फोसाइट्स इन क्षेत्रों में विरल रूप से बिखरे हुए हो सकते हैं और / या कूप जैसी संरचनाएं बना सकते हैं, जो एमएस 8,9 के साथ मनुष्यों में भी देखे जाते हैं। नियंत्रण के रूप में भोले चूहों का उपयोग करने के अलावा, एक पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) -केवल प्रेरण किट का उपयोग किया जा सकता है (यानी, एमओजी प्रोटीन के बिना ईएई चूहों को दिए जाने वाले एक समान प्रेरण इमल्शन)। ईएई माउस मॉडल में, रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) निष्क्रिय है और एंटीबॉडी जैसी बड़ी संस्थाओं को पार करने की अनुमति देता है। सीडी 19-एमएबी रेडियोट्रेसर केवल सीएनएस में बंधेगा और रहेगा यदि बी कोशिकाएं मौजूद हैं; यदि बी कोशिकाएं मौजूद नहीं हैं तो ट्रेसर रक्त पूल में वापस फैल जाएगा। हमने ऊतकों में रेडियोधर्मिता के स्तर को मापने से पहले सीएनएस ऊतकों की गामा गिनती और एक्स विवो ऑटोरेडियोग्राफी का उपयोग करके इसका प्रदर्शन किया है। हमने सीएनएस1,2 में बी कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एमएबी-आधारित पीईटी रेडियोट्रेसर (यानी, इम्यूनोपीईटी इमेजिंग दृष्टिकोण) के उपयोग की रिपोर्ट करने वाले पहले प्रकाशनों में भी इसका प्रदर्शन किया है।

डीओटीए चेलेटर का उपयोग किया गया था क्योंकि इसका उपयोग कॉपर -64 लेबल पेप्टाइड्स और एंटीबॉडी के साथ नैदानिक पीईटी इमेजिंग में किया गया है, और हमारा उद्देश्य एमएस रोगियों की नैदानिक इमेजिंग के लिए एचसीडी 19-एमएबी का अनुवाद करना है। डोटा का विवो में कॉपर -64 के साथ पर्याप्त बाध्यकारी संबंध है। विवो स्थिरता बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि मुक्त 64क्यू यकृत में जाता है और बाध्य रेडियोट्रेसर के संकेत को अस्पष्ट कर सकता है; इस प्रकार, अन्य अंगों की तुलना में सापेक्ष संकेत की गणना करने के लिए यकृत में संकेत को मापना महत्वपूर्ण है। मांसपेशियों को आमतौर पर एक नियंत्रण ऊतक के रूप में लिया जाता है, लेकिन ईएई के मामले में, मांसपेशियों में सूजन मौजूद हो सकती है। 64सीयू का आधा जीवन 12.7 घंटे है, जो डीओटीए-एचसीडी 19-एमएबी को अपने लक्ष्य से बांधने के लिए पर्याप्त समय देता है, जबकि यह सुनिश्चित करता है कि सिग्नल को पीईटी द्वारा मापा जा सकता है। संयुग्म तैयार करते समय, वांछित डीओटीए / एमएबी अनुपात का उत्पादन करने के लिए एमएबी में जोड़ने के लिए डीओटीए की मात्रा निर्धारित करने के लिए छोटे पैमाने पर (75-125 μg) परीक्षण प्रतिक्रियाएं की जानी चाहिए (उदाहरण के लिए, 6-10 गुना अतिरिक्त डीओटीए-एनएचएस-एस्टर प्रति मोल एमएबी की प्रतिक्रिया 1-2 डीओटीए / एमएबी के संयुग्म को वहन कर सकती है)। प्रतिक्रिया समय और तापमान (उदाहरण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर 2-4 घंटे या रात भर) भी डीओटीए / एमएबी अनुपात को प्रभावित करता है और इसे अनुकूलित किया जाना चाहिए। प्रति एमएबी डीओटीए की संख्या की गणना करने के लिए गैर-रेडियोधर्मी तांबे के साथ एक अनुमापन किया जा सकता है; हालांकि, हम अधिक विश्वसनीय और सटीक परिणामों के लिए माल्डी-एमएस और / या एलसी-एमएस करने की सलाह देते हैं।

गणना की गई डीओटीए / एमएबी अनुपात एक विशेष नमूने के लिए एक औसत मूल्य है और कुछ भिन्नता अपेक्षित है। माल्डी के लिए, संयुग्मित और असंगत एमएबी के लिए प्रति नमूने कई शॉट्स लिए जाते हैं। फिर हम डीओटीए / एमएबी की औसत संख्या निर्धारित करने के लिए संयुग्मित से असंयुग्मित के अनुपात की गणना करते हैं। डीओटीए / एमएबी अनुपात महत्वपूर्ण है क्योंकि बहुत सारे चेलेटर एंटीबॉडी बाइंडिंग को बाधित करेंगे और बहुत कम असंगत रेडियोलेबलिंग और कम सिग्नल का कारण बनेंगे। लगातार सिग्नल तीव्रता और बाध्यकारी कैनेटीक्स को बनाए रखने के लिए संयुग्म के बैचों के बीच अनुपात बहुत करीब होना चाहिए; आदर्श रूप से, संयुग्म के एक ही बैच का उपयोग किसी विशेष अध्ययन के भीतर सभी प्रयोगों के लिए किया जाना चाहिए। संभावित ओवरकोन्जेशन के कारण विकृति पर संभावित प्रभावों को कम करने के लिए एक आशाजनक तकनीक साइट-विशिष्ट संयुग्मन10 का उपयोग करना है, जिससे एंटीबॉडी के भारी श्रृंखला ग्लाइकेन पर चेलेटर संयुग्मन साइट-चयनात्मक होता है, इस प्रकार प्रति एमएबी 1 चेलेटर को जोड़ने की गारंटी देता है।

रेडियोलेबलिंग प्रतिक्रिया स्थितियों को उच्चतम लेबलिंग दक्षता और उपज सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए क्योंकि एंटीबॉडी, डीओटीए / एमएबी अनुपात और 64क्यू मोलर गतिविधि में अंतर, अन्य स्थितियों के बीच, रेडियोलेबलिंग को प्रभावित करेगा। इष्टतम 64क्यू से एमएबी संयुग्म अनुपात का उपयोग करने से रेडियोट्रेसर को शुद्धिकरण के बिना उपयोग करने की अनुमति मिल सकती है, जिससे गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ और रेडियोधर्मी क्षय के कारण रेडियोलेबलिंग और हानि के लिए आवश्यक समय कम हो सकता है। एक सुसंगत और विश्वसनीय दाढ़ गतिविधि भी प्राप्त की जा सकती है जब एक ही 64क्यू से एमएबी संयुग्म अनुपात का उपयोग किया जाता है, जो चूहों या इमेजिंग अध्ययनों के कई समूहों में परिणामों की तुलना करते समय विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। आईटीएलसी शर्तों को प्रत्येक उपयोगकर्ता के अनुरूप संशोधित भी किया जा सकता है। यदि शुद्धिकरण आवश्यक है, तो एचपीएलसी और / या यूवी / विस स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के लिए एक एलिकोट बचाया जाना चाहिए ताकि दाढ़ गतिविधि की गणना की जा सके।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इमेजिंग के लिए रेडियोलेबल एंटीबॉडी का उपयोग करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। यह आवश्यक है कि रेडियोट्रेसर के लिए उपयोग किया जाने वाला एंटीबॉडी जैविक रूप से निष्क्रिय हो ताकि शारीरिक प्रभाव न हो। इसके अलावा, चूंकि एंटीबॉडी का एक लंबा रक्त निवास होता है, इसलिए छवि की गुणवत्ता से समझौता किए बिना एक उपयुक्त सिग्नल-टू-बैकग्राउंड सुनिश्चित करने के लिए किसी दिए गए एमएबी के परिसंचरण, बंधन और निकासी के लिए लंबे समय तक इंतजार करना चाहिए। आमतौर पर 64 क्यू-लेबल एमएबी के लिए 20-48 घंटे तक इंतजार करना पर्याप्त है, लेकिन किसी दिए गए कृंतक मॉडल में इमेजिंग के लिए सबसे अच्छा समय बिंदु निर्धारित करने के लिए एक नए एमएबी पीईटी ट्रेसर का आकलन करते समय इंजेक्शन के बाद 2, 4, 4, 6, 12, 24, 48 घंटे की छवि बनानी चाहिए। उच्चतम सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात के साथ एआरजी छवियों को प्राप्त करने के लिए भी यही सच है। इस प्रोटोकॉल में प्रतिनिधि छवियों को इंजेक्शन के बाद 18-20 घंटे में लिया गया था, हालांकि उपयोग किए गए रेडियोआइसोटोप के आधार पर अन्य समय बिंदुओं का उपयोग किया जा सकता है। सीडी 19 के विभिन्न एपिटोप्स से बंधे विभिन्न एंटीबॉडी अलग-अलग परिणाम उत्पन्न करेंगे और उन्हें सख्ती से विशेषता दी जानी चाहिए।

रीढ़ की हड्डी के संकेत का विश्लेषण करते समय, सांस लेने के कारण होने वाली गति को कम करने के लिए स्कैनिंग बिस्तर में अपनी पीठ पर चूहों को रखना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, लापरवाह प्लेसमेंट चूहों में रीढ़ की हड्डी को सीधा करने में मदद कर सकता है जिन्होंने ईएई रोग की प्रगति के कारण रीढ़ की हड्डी की वक्रता में वृद्धि की है। रीढ़ और रीढ़ की हड्डी में संकेत का पता लगाने का लक्ष्य रखते समय विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण पहलू फ्लैंक पर एमओजी1-125 इंजेक्ट करने से बचना है क्योंकि इंजेक्शन साइटें उन क्षेत्रों में संबंधित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण ट्रेसर को बांध सकती हैं। इंजेक्शन साइट की निकटता रीढ़ की हड्डी के विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकती है; इस प्रकार, छाती में इंजेक्शन यहां वर्णित आवेदन के लिए बेहतर हैं।

उपयोग की जाने वाली छवि विश्लेषण तकनीक सीएनएस इमेजिंग के लिए विशिष्ट हैं। छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर एक मस्तिष्क एटलस उपकरण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय परिणाम प्रदान करता है जब तक कि पीईटी और सीटी का पंजीकरण सटीक है। अर्ध-स्वचालित 3 डी मस्तिष्क एटलस का उपयोग करना और प्रत्येक माउस की खोपड़ी को फिट करने के लिए इसे समायोजित करना जानवरों के बीच लगातार आरओआई की अनुमति देता है। चूंकि रीढ़ की हड्डी में सिग्नल का विश्लेषण करने के लिए वर्तमान में कोई स्वचालित या अर्ध-स्वचालित दृष्टिकोण नहीं है, इसलिए मैनुअल आरओआई तैयार किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, सीडी 19 + बी कोशिकाओं (या अस्थि मज्जा और रीढ़ की हड्डी दोनों में मौजूद किसी भी सेल प्रकार) की मात्रा निर्धारित करते समय, रीढ़ की हड्डी के स्तंभ और अस्थि मज्जा से उत्पन्न होने वाले संकेत को यथासंभव समाप्त करना महत्वपूर्ण है। इसका कारण यह है कि भोले चूहों को ईएई चूहों की तुलना में उनके अस्थि मज्जा में अधिक सीडी 19 + बी कोशिकाओं के लिए जाना जाता है, जिसमें बी कोशिकाएं सीएनएस 5,11 में घुसपैठ करने के लिए परिधि छोड़ देती हैं। यह अस्थि मज्जा संकेत रीढ़ की हड्डी में सही संकेत को अस्पष्ट कर सकता है।

रीढ़ की हड्डी के स्तंभ और अस्थि मज्जा से संकेत के योगदान को कम करते हुए सच्चे रीढ़ की हड्डी के संकेत को चित्रित करने के लिए, सीटी छवि के ओत्सु थ्रेशोल्डिंग का उपयोग रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के लिए एक अपरिवर्तनीय आरओआई बनाने के लिए किया जा सकता है। एक अलग रीढ़ की हड्डी आरओआई तब रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के भीतर आसानी से खींचा जा सकता है। फीमर में अस्थि मज्जा को मापने के लिए भी इसी तकनीक का उपयोग किया जा सकता है। रीढ़ की हड्डी में ट्रेसर बाइंडिंग में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए यह एक बहुत ही उपयोगी तरीका है। हालांकि, पीईटी के अपेक्षाकृत कम स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और चूहों के छोटे शारीरिक क्षेत्रों को स्कैन करते समय आंशिक मात्रा प्रभाव से संबंधित मुद्दों के कारण, अतिरिक्त पूर्व विवो पुष्टिकरण तकनीकों (जैसे, गामा गिनती, एआरजी) का उपयोग रक्त, मस्तिष्कमेरु द्रव, या रीढ़ की हड्डी के स्तंभ से स्पिलओवर सिग्नल की उपस्थिति के बिना रीढ़ की हड्डी में रेडियोट्रैसर बाइंडिंग के सत्यापन को सक्षम बनाता है।

वक्ष रीढ़ की हड्डी में संकेत रोग की गंभीरता के आधार पर ईएई चूहों में भिन्न होता है और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान कितनी बी कोशिकाएं घुसपैठ करती हैं। घुसपैठ करने वाली बी कोशिकाओं की संख्या में यह भिन्नता, साथ ही भोले चूहों के श्रोणि / रीढ़ की हड्डी के अस्थि मज्जा की तुलना में सीएनएस में बी कोशिकाओं की छोटी मात्रा, चूहों में रीढ़ की हड्डी के ऊतकों की विवो मात्रा को चुनौतीपूर्ण बना सकती है। छोटे पशु इमेजिंग में पीईटी के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन को देखते हुए, अस्थि मज्जा से संकेत रीढ़ की हड्डी के संकेत पर फैल सकता है। पूर्व विवो बायोडिस्ट्रीब्यूशन और ऑटोरेडियोग्राफी यहां पूरी की गई कशेरुक बनाम रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के पीईटी संकेत को मान्य करने में सहायता करती है। चूहों को रक्त पूल में किसी भी अनबाउंड ट्रेसर को हटाने के लिए विच्छेदन से पहले संक्रमित किया जाता है ताकि गामा गिनती और ऑटोरेडियोग्राफी परिणाम उस ट्रेसर को प्रतिबिंबित करें जो वास्तव में उस अंग में रक्त पूल में ट्रेसर के बजाय प्रत्येक अंग में बंधा होता है।

रेडियोट्रेसर रक्त के माध्यम से प्रसारित होते हैं, और एंटीबॉडी ट्रेसर के साथ, विशेष रूप से, प्रारंभिक इंजेक्शन के बाद हफ्तों तक रक्त में अक्सर अनबाउंड रेडियोट्रेसर मौजूद होता है। चूंकि हम मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की इमेजिंग कर रहे हैं, जिसमें कई रक्त वाहिकाएं हैं, इसलिए यह समझना महत्वपूर्ण है कि सिग्नल का कौन सा हिस्सा वास्तव में मस्तिष्क / ऊतक में ट्रेसर बाइंडिंग के कारण है। इस प्रकार हृदय / रक्त पूल में संकेत द्वारा मस्तिष्क संकेत को विभाजित करना आवश्यक है। नैदानिक सेटिंग में, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के कशेरुक और आरओआई के ओत्सु थ्रेशोल्डिंग की एक ही छवि विश्लेषण तकनीकों का उपयोग परिमाणीकरण के लिए किया जा सकता है। चूहों की तुलना में मनुष्यों में बड़े ऊतक की मात्रा को देखते हुए, आंशिक मात्रा प्रभावों से काफी कम प्रभाव होना चाहिए, जिससे सटीकता में सुधार होता है और विवो निष्कर्षों में पुष्टि करने के लिए पूर्व विवो तकनीकों की आवश्यकता को नकार दिया जाता है। क्लिनिक में पीईटी का उपयोग चिकित्सकों को उनके व्यक्तिगत बी सेल बोझ के आधार पर प्रत्येक रोगी के लिए चिकित्सा को निजीकृत करने की अनुमति देगा।

एआरजी विशेष रूप से उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयोगी है ताकि मस्तिष्क स्टेम और सेरिबैलम जैसे छोटे क्षेत्रों में ट्रेसर बाइंडिंग के स्थानिक स्थान का अधिक सटीक चित्रण किया जा सके। बी कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल दाग के लिए समान वर्गों और / या आसन्न वर्गों को बचाया जा सकता है। हमने पहले सीएनएस ऊतकों को सीडी 45 आर / बी 220 (पूरक चित्रा एस 1) के साथ चित्रित किया है ताकि पीईटी और एआरजी सिग्नल 5,9 के साथ बी कोशिकाओं की संख्या को सहसंबंधित किया जा सके। धुंधलापन की तुलना एआरजी परिणामों से की जा सकती है ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि रेडियोट्रेसर सिग्नल धुंधला पैटर्न से मेल खाता है। बी कोशिकाएं समूहों में मौजूद हो सकती हैं या पूरे मस्तिष्क स्टेम में फैल सकती हैं; पीईटी संवेदनशीलता संकेत को मापने के लिए पर्याप्त रूप से उच्च है, जो नैदानिक अनुवाद के लिए उत्साहजनक है। रीढ़ की हड्डी एआरजी के लिए, कशेरुक से रीढ़ की हड्डी को हटाने से यह सुनिश्चित होता है कि मापा गया संकेत अस्थि मज्जा और / या रक्त के बजाय रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में ट्रेसर बाइंडिंग के कारण है, जो आंशिक मात्रा प्रभाव के कारण पीईटी छवियों को अस्पष्ट कर सकता है।

एआरजी के समान, एक्स विवो गामा गिनती व्यक्तिगत अंगों में रेडियोधर्मी संकेत की मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाती है। इस विशेष तकनीक के लिए, ऊतकों के गीले वजन को मापना और यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि वे गामा काउंटर में ट्यूबों को रखने से पहले अपने संबंधित ट्यूबों के तल पर हैं। ट्यूबों को माउस संख्या और ऊतक के साथ लेबल किया जाना चाहिए, ताकि सही ट्यूब का उपयोग किया जा सके; ट्यूब को तब एक कैलिब्रेटेड संतुलन पर तौला जाता है और अंगों को माइक्रोग्राम (0.0001 मिलीग्राम) के निकटतम दसवें हिस्से में डाला जाता है। कुछ ऊतक बेहद छोटे होते हैं और पहले और बाद में ट्यूब द्रव्यमान में अंतर 0.0001 मिलीग्राम के क्रम में होगा। नमी के नुकसान को रोकने के लिए विच्छेदन के तुरंत बाद ऊतकों को तौला जाना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप कम द्रव्यमान होता है। वजन के बाद, एआरजी के लिए इन ऊतकों को फ्रीज करने से पहले सूखने से रोकने के लिए मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की नलियों को पीबीएस से भरा जाना चाहिए।

Disclosures

सीडी 19 एंटीबॉडी को क्षितिज थेरेप्यूटिक्स द्वारा प्रदान किया गया था।

Acknowledgments

हम स्टैनफोर्ड में एससीआई 3 लघु-पशु इमेजिंग सुविधा और पीईटी / सीटी के साथ तकनीकी सहायता के लिए डॉ फ्रेज़घी हब्ते के समर्थन के लिए आभारी हैं। हम एचसीडी 19-एमएबी प्रदान करने के लिए क्षितिज थेरेप्यूटिक्स और विशेष रूप से जोडी कार्नेल को उनके तकनीकी मार्गदर्शन और समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच एनआईएनडीएस (1 आर 01 NS114220-01 ए 1) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL 50 kDa MWCO Centrifugal filter MiliporeSigma UFC505008 centrifugal filter
64Cu-CuCl3 Washington University in St. Louis; University of Wisonsin, Madison; or another vendor
AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner Eckert & Ziegler AR-2000
Autoradiography cassette Cole Palmer EW-21700-34 Aluminum, 8" x 10"
Autoradiography film  GE Life Sciences 28-9564-78 Storage Phosphor Screen BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, screen only
Butterfly Needle Catheter SAI Infusion Technologies BLF-24
DOTA-NHS-ester Macrocyclics B-280
EAE Induction Kit Hooke Laboratories EK-2160
Geiger Counter Ludlum 14C
GNEXT PET/CT Scanner Sofie GNEXT
Hidex Automatic Gamma Counter Hidex AMG
HPLC Column Phenomenex  00H-2146-K0 5 μm SEC-s3000 400 Å, 300 x 7.8 mm
Illustra NAP-5 column Cytiva 17085301 DNA gravity column
Image J NIH ARG analysis software
Low Protein Binding Collection Tubes (1.5 mL) Thermo Scientific PI90410
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Scientific 840281400 UV-Vis micro/nano-spectrophotometer
PCR tubes 0.2 mL, for DNA grade Eppendorf 30124707
Typhoon phosphor imager 9410 GE Healthcare 8149-30-9410
VivoQuant Invicro Version 4 Patch 3 PET Analysis Software; must purchase brain atlas add-on
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Scientific PI89882 Desalting column

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References

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इमेजिंग सीडी 19 + बी कोशिकाएं प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस माउस मॉडल पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी मल्टीपल स्केलेरोसिस डिमाइलेटिंग सेंट्रल नर्वस सिस्टम रोग बी लिम्फोसाइट्स एमएस पैथोलॉजी एंटी-बी सेल थेरेपी पीईटी इमेजिंग विवो स्पैटियोटेम्पोरल वितरण में बी सेल लोड पीईटी ट्रेसर मानव सीडी 19 + बी कोशिकाएं एमएस के बी सेल-संचालित माउस मॉडल माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन 1-125 मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी इमेजिंग विवो पीईटी इमेजिंग में पूर्व विवो गामा गिनती रोग-प्रासंगिक अंग ऑटोरेडियोग्राफी
पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी का उपयोग करके एक प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफलोमाइलाइटिस माउस मॉडल में इमेजिंग सीडी 19 <sup>+</sup> बी कोशिकाएं
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Reyes, S. T., Azevedo, E. C.,… More

Reyes, S. T., Azevedo, E. C., Cropper, H. C., Nagy, S., Deal, E. M., Chaney, A. M., James, M. L. Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography. J. Vis. Exp. (191), e64133, doi:10.3791/64133 (2023).

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