Wesentliche Bestandteile von Borreliella (Borrelia) burgdorferi In-vitro-Transkriptionsassays

Summary

In-vitro-Transkriptionsassays können die Mechanismen der Transkriptionsregulation in Borreliella burgdorferi entschlüsseln. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Aufreinigung der B. burgdorferi RNA-Polymerase und zur Durchführung von In-vitro-Transkriptionsreaktionen. Experimentelle Ansätze mit In-vitro-Transkriptionsassays erfordern eine zuverlässige Aufreinigung und Lagerung der aktiven RNA-Polymerase.

Abstract

Borreliella burgdorferi ist ein bakterieller Erreger mit begrenzten metabolischen und genomischen Repertoires. B. burgdorferi transpiriert extrazellulär zwischen Wirbeltieren und Zecken und verändert sein Transkriptionsprofil dramatisch, um während der Infektion in unterschiedlichen Umgebungen zu überleben. Ein Schwerpunkt der Studien von B. burgdorferi ist es, klar zu verstehen, wie das Bakterium durch transkriptionelle Veränderungen auf seine Umgebung reagiert. In-vitro-Transkriptionsassays ermöglichen es, die grundlegenden Mechanismen der Transkriptionsregulation biochemisch zu analysieren. In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, das die Reinigung und Lagerung von B. burgdorferi RNA-Polymerase, die Aufreinigung des Sigma-Faktors, die Generierung von DNA-Vorlagen und In-vitro-Transkriptionsassays beschreibt. Das Protokoll beschreibt die Verwendung von RNA-Polymerase, die aus B. burgdorferi 5A4 RpoC-His (5A4-RpoC) gereinigt wurde. 5A4-RpoC ist ein bereits publizierter Stamm, der einen 10XHis-Tag auf dem rpoC-Gen trägt, das für die größte Untereinheit der RNA-Polymerase kodiert. In-vitro-Transkriptionsassays bestehen aus der RNA-Polymerase, die aus dem Stamm 5A4-RpoC gereinigt wurde, einer rekombinanten Version des Housekeeping-Sigma-Faktors RpoD und einer PCR-generierten doppelsträngigen DNA-Vorlage. Während die Proteinreinigungstechniken und -ansätze zur Assemblierung von In-vitro-Transkriptionsassays konzeptionell gut verstanden und relativ verbreitet sind, unterscheiden sich die Überlegungen zur Handhabung von RNA-Polymerasen oft von Organismus zu Organismus. Das hier vorgestellte Protokoll ist für enzymatische Untersuchungen an der B. burgdorferi RNA-Polymerase konzipiert. Die Methode kann angepasst werden, um die Rolle von Transkriptionsfaktoren, Promotoren und posttranslationalen Modifikationen auf die Aktivität der RNA-Polymerase zu testen.

Introduction

Borreliose und Rezidivfieber werden durch Spirochätenerreger der Gattungen Borrelien und Borreliella^{verursacht 1,2,3}. Die Lyme-Borreliose ist eine prominente vektorübertragene Krankheit in Nordamerika, und daher ist Borreliella burgdorferi ein prominenter Modellorganismus zur Untersuchung der Spirochätenbiologie ^4,5. Untersuchungen der Mechanismen der transkriptionellen Regulation von B. burgdorferi zielen darauf ab, seine Anpassungen an Veränderungen in der Umwelt besser zu verstehen, während er zwischen seinem Zeckenvektor und Säugetierwirten wechselt ^6,7. Veränderungen des pH-Werts, der Temperatur, der Osmolarität, der Nährstoffverfügbarkeit, der kurzkettigen Fettsäuren, der organischen Säuren sowie des Gehalts an gelöstem Sauerstoff und Kohlendioxid modulieren die Expression von Genen, die für das Überleben von B. burgdorferi in seinem Arthropodenvektor und für die Infektion von Tieren wichtig sind 8,9,10,11,12,13,14,15^,16,17,18. Die Verknüpfung dieser Reaktionen auf Reize mit regulatorischen Mechanismen war ein wichtiger Aspekt der Forschung von B. burgdorferi ¹⁹.

Transkriptionsfaktoren und Sigma-Faktoren steuern die Transkription von Genen, die zelluläre Prozesse ausführen. Lyme-Borreliose und schubförmige Spirochäten beherbergen eine relativ spärliche Anzahl von Transkriptionsfaktoren und alternativen Sigmafaktoren. Trotzdem gibt es komplexe transkriptionelle Veränderungen, die die Reaktionen von B. burgdorferi auf die Umwelt lenken^20,21,22. Die spezifischen Mechanismen, die zu transkriptionellen Veränderungen in B. burgdorferi als Reaktion auf Umweltveränderungen führen, sind noch unklar. In-vitro-Transkriptionsassays sind leistungsstarke Werkzeuge für die Anwendung eines biochemischen Ansatzes zur Untersuchung der Funktion und der regulatorischen Mechanismen von Transkriptionsfaktoren und Sigma-Faktoren^23,24,25,26.

Ein In-vitro-Transkriptionsassay-System mit der RNA-Polymerase von B. burgdorferi wurde kürzlich etabliert²⁴. Da Bakterien oft eine einzigartige zelluläre Physiologie aufweisen, reagieren RNA-Polymerasen verschiedener Spezies und Gattungen unterschiedlich auf Enzymreinigung, Enzymspeicherung und Reaktionspufferbedingungen²⁷. B. burgdorferi ist auch genetisch weit von den vielen Bakterienarten entfernt, an denen RNA-Polymerasen untersucht wurden²⁰. Aspekte der Enzymvorbereitung wie Lyse-, Wasch- und Elutionspufferbedingungen, Speicherpuffer, In-vitro-Transkriptionsreaktionspuffer und die Methode der Assay-Konstruktion können alle die RNA-Polymerase-Aktivität verändern. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Aufreinigung von RNA-Polymerase und Sigma-Faktor RpoD, die Herstellung von linearen doppelsträngigen DNA-Matrizen und die Konstruktion von In-vitro-Transkriptionsassays zur Verfügung, um die Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien, die dieses System verwenden, zu erleichtern. Wir beschreiben eine Beispielreaktion, um den linearen Bereich für die RpoD-abhängige Transkription zu demonstrieren und diskutieren Einschränkungen und Alternativen zu diesem Ansatz.

Protocol

1. Aufreinigung der RNA-Polymerase und Herstellung des RNA-Polymerase-Stammes Das Zellpellet wird aus 2-4 l B. burgdorferi RpoC-His10X, kultiviert in BSKI-Medium in einer mikroaerophilen Umgebung (34 °C, 5 % CO 2, 3 %O2) auf eine Dichte von2-4 x 107 Zellen/ml unter Verwendung der zuvor beschriebenen Zellentnahmeprotokollegesammelt 28,29. Die Zentrifugation bei 10.000 x g bei 4 °C für…

Representative Results

Bei einer in vitro Transkriptionsreaktion, bei der der limitierende Schritt der Reaktion die Sigma-Faktor-vermittelte Transkriptionsinitiierung ist, sollte die Transkriptionsaktivität linear mit der Menge des Sigma-Faktors zunehmen. Wir stellen die Vorbereitung von in vitro Transkriptionsexperimenten vor, bei denen eine Reihe von RpoD-Konzentrationen zusammen mit zwei Konzentrationen von RNA-Polymerase getestet werden, um das resultierende unterschiedliche Signal des radioaktiv markierten Nukleotideinbaus i…

Discussion

In-vitro-Transkriptionsassays, die mit dem vorgestellten Protokoll konstruiert wurden, wurden kürzlich verwendet, um die Rolle eines Transkriptionsfaktors in B. burgdorferi zu untersuchen, und können für ähnliche Experimente mit anderen Transkriptionsfaktoren, Sigma-Faktoren und Molekülen verwendet werden²³. Sobald die aktive RNA-Polymerase aus B. burgdorferi gewonnen und ihre Aktivität nachgewiesen wurde, können Komponenten und Bedingungen innerhalb der In-vitro-…

Materials

0.45 micron syringe filter	Thermo Scientific	726-2545	Step 1.7 and 2.3
50 mL conical tubes	MidSci	C50B	Step 1.3, and subsequent steps
50 mL high-speed centrifuge tubes	Thermo Scientific	3119-0050PK	Step 1.2
500 mL Centrifuge bottles	Thermo Scientific	3120-9500PK	Step 1.1
B-PER and instruction manual	Thermo Scientific	78248	Step 1.4 and 2.2
Calcium chloride	Fisher Scientific	10035-04-8	Step 2.6
Centrifugal filters 10 Kd cutoff	Millipore Sigma	UFC8010	Step 1.11 and 2.11
Cobalt resin and instruction manual	Thermo Scientific	89969	Step 1.9
Dithiothreitol	Acros Organics	426380500	Step 1.4 and subsequent steps
Dnase (Nuclease)	Millipore Sigma	70746	Step 1.4 and 2.2
Factor Xa Protease	Haematologic Technologies	HCXA-0060	Step 2.6
GE Typhoon 5 Phosphoimager	GE lifesciences	Multiple	Step 4.15
Gel Imager	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
H2O for in vitro transcription	Fisher Scientific	7732-18-5	Step 3.2 and 3.3
high fidelity PCR kit	New England Biolabs	M0530S	Step 3.1
High-speed centrifuge	Eppendorf		Step 1.1, and subsequent steps
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva Life Sciences	17040601	Step 2.8
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750-100G	Step 1.9
Lysozyme	Thermo Scientific	90082	Step 1.4 and 2.2
Magnesium chloride	Fisher Scientific	S25401	Step 4.1
Manganese chloride	Fisher Scientific	S25418	Step 4.1
Mini protean tetra cell	Bio-Rad	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
NP-40	Thermo Scientific	85124	Step 4.1
NTP mixture	Thermo Scientific	R0481	Step 4.1
PCR purification kit	Qiagen	28506	Step 3.2
PCR tubes	MidSci	PR-PCR28ACF	Step 1.12
PD-10 Sephadex buffer exchange column and instruction manual	Cytiva	17085101	Step 1.10 and 2.10 (gel filtration column)
pMAL Protein Fusion and Purification System Instruction manual	New England Biolabs	E8200S	Step 2.1
Polyacrylamide gels AnyKD	Bio-Rad	456-8125	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
Potassium glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Step 4.1
Protease inhibitor	Thermo Scientific	78425	Step 1.4 and 2.2
Radiolabeled ATP	Perkin Elmer	BLU503H	Step 4.2
RNA Loading Dye, (2x)	New England Biolabs	B0363S	Step 4.13
Rnase inhibitor	Thermo Scientific	EO0381	Step 4.1
Spectrophotometer	Biotek	Mutiple	Step 1.13 and subsequent protien quality check steps
TBE-Urea gels 10 percent	Bio-Rad	4566033	Step 4.14