Principes de base de l’histologie et détection de la mort cellulaire dans les tissus d’abeilles mellifères
Summary
Les méthodes immunohistochimiques sont utiles dans la recherche sur les abeilles mellifères pour détecter et évaluer le niveau d’apoptose et de nécrose dans l’intestin moyen et les glandes hypopharyngées des abeilles adultes.
Abstract
Les abeilles mellifères (Apis mellifera L.) à l’intérieur de la ruche (ouvrières nourricières et autres abeilles de la ruche) et à l’extérieur de la ruche (butineuses) sont exposées aux changements climatiques et météorologiques, à divers pesticides, agents pathogènes et à la malnutrition, pénétrant principalement par la bouche et affectant principalement le tube digestif des abeilles adultes. Pour comprendre et prévenir les effets de ces facteurs de stress externes et internes sur les abeilles, une méthode de recherche utile est la méthode immunohistochimique. Un protocole de base est décrit pour préparer l’intestin moyen (ventriculus) et les glandes hypopharyngées (HPG) des abeilles adultes pour l’analyse histologique. Une méthodologie détaillée est décrite pour évaluer le niveau de dommages cellulaires et distinguer la nécrose de la mort cellulaire programmée (apoptose) en tant que processus naturel de régénération tissulaire. Les résultats du traitement des abeilles adultes avec de l’acide oxalique et des pesticides (insecticide et acaricide) et la détermination de la mort cellulaire dans le ventriculus et les HPG sont présentés. Les avantages et les inconvénients de la méthodologie sont également discutés.
Introduction
Les abeilles mellifères (Apis mellifera L.) sont, entre autres pollinisateurs sauvages, les pollinisateurs les plus importants des plantes agricoles. Pendant des milliers d’années, l’environnement changeant a incité les abeilles à adapter leur morphologie, leur physiologie, leur comportement et leur tolérance à plusieurs agents pathogènes et parasites. Par conséquent, les abeilles mellifères ont développé une gamme très diversifiée d’espèces et de sous-espèces dans le mondeentier 1. Ces résultats sont cohérents avec les résultats précédents, qu’il existe une variation génétique dans la structure du tube digestif de l’abeille, mais suggèrent également que les altérations de l’intestin moyen sont dues à des facteurs environnementaux 2,3.
Le tube digestif de l’abeille a trois parties principales: l’intestin antérieur, l’intestin moyen (ventriculus) et l’intestin postérieur4. Le ventriculus est un organe essentiel pour la digestion du pollen et du nectar/miel ; Dans l’intestin postérieur, le contrôle osmotique a lieu par absorption d’eau et d’ions2. Les glandes hypopharyngées (HPG) des ouvrières apicoles sont situées dans la tête et synthétisent et sécrètent des composants de gelée royale pour nourrir la couvée, la reine et les membres de la colonie. Leur taille change avec l’âge et les tâches et dépend d’une bonne nutrition (pollen de qualité). Les infirmières et infirmiers âgés de 6 à 18 jours effectuent l’élevage des couvées, et la taille des HPG augmentede 5,6. Chez les abeilles butineuses, les HPG dégénèrent et ne sécrètent que les enzymes importantes pour convertir les sucres complexes en sucres simples (α-glucosidases, leucine arylamidase, invertase) dans le miel7.
Les abeilles mellifères sont exposées à plusieurs facteurs de stress biotiques et abiotiques8, et le tube digestif peut être affecté par plusieurs stimulants négatifs. La première barrière qui protège l’organisme contre les agents pathogènes est la membrane péritrophique de l’intestin moyen, constituée de muqueuse intestinale pour protéger contre les agents pathogènes4. Le développement et la fonction des HPG dépendent de l’alimentation, de l’âge et de l’état de la colonie9, et sont affectés par les insecticides, les acaricides 10 et les agents pathogènes11,12,13. Les résidus d’acaricides dans la ruche dus au traitement de lutte contre le varroa et aux pesticides de l’environnement affectent les abeilles butineuses et les abeilles nourrices14,15. La plus grande menace pour les colonies d’abeilles mellifères est l’acarien Varroa destructor, à la fois en tant que vecteur de virus contribuant aux pertes de colonies16 et en tant que consommateur du corps adipeux de l’hôte (un organe vital important chez les abeilles mellifères), ce qui affecte par conséquent le corps de l’individu et les fonctions de la colonie17.
Cependant, les habitats agricoles intensifs peuvent fournir un approvisionnement alimentaire à court terme pour les abeilles mellifères. Par conséquent, les programmes agroenvironnementaux devraient améliorer la disponibilité des fleurs mellifères dans les paysages agricoles18. Pour évaluer la morphologie de différentes sous-espèces 6,19,20,21 ou les effets sublétaux de ces facteurs au niveau des cellules ou des tissus, en particulier l’intestin moyen et les HPG, les méthodes histologiques et immunohistochimiques sont pratiques et suffisamment précises pour être utilisées dans la recherche histologique sur les abeilles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les organismes vivants, la mort cellulaire est définie comme l’apoptose ou la nécrose25 et peut être accompagnée d’autophagie26. La différence entre les cellules apoptotiques et nécrotiques est que l’apoptose est une forme de mort cellulaire programmée et apparaît dans les cellules normales, alors que la nécrose se produit en raison de conditions mortelles (p. ex. accident, maladie)27,28. L’apo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Je remercie l’Agence slovène de recherche, subvention n° P4-133, pour son soutien.
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
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