मधुमक्खी ऊतक में हिस्टोलॉजी मूल बातें और कोशिका मृत्यु का पता लगाना
Summary
इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधियां मधुमक्खी अनुसंधान में वयस्क मधुमक्खियों के मिडगट और हाइपोफैरेनजील ग्रंथियों में एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस के स्तर का पता लगाने और आकलन करने के लिए उपयोगी हैं।
Abstract
छत्ते के अंदर (नर्स श्रमिक और अन्य छत्ते मधुमक्खियां) और छत्ते के बाहर मधुमक्खियां (एपिस मेलिफेरा एल) जलवायु और मौसम परिवर्तन, विभिन्न कीटनाशकों, रोगजनकों और कुपोषण के संपर्क में आती हैं, मुख्य रूप से मुंह के माध्यम से प्रवेश करती हैं और मुख्य रूप से वयस्क मधुमक्खियों के पाचन तंत्र को प्रभावित करती हैं। मधुमक्खियों पर इस तरह के बाहरी और आंतरिक तनावों के प्रभावों को समझने और रोकने के लिए, एक उपयोगी शोध विधि इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधि है। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए वयस्क मधुमक्खियों के मिडगट (वेंट्रिकुलस) और हाइपोफैरेनजील ग्रंथियों (एचपीजी) को तैयार करने के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। कोशिका क्षति के स्तर का आकलन करने और ऊतक पुनर्जनन की प्राकृतिक प्रक्रिया के रूप में प्रोग्राम्ड सेल डेथ (एपोप्टोसिस) से नेक्रोसिस को अलग करने के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन किया गया है। ऑक्सालिक एसिड और कीटनाशकों (कीटनाशक और एक्रिसाइड) के साथ वयस्क मधुमक्खी उपचार के परिणाम और वेंट्रिकुलस और एचपीजी में कोशिका मृत्यु का निर्धारण प्रस्तुत किया गया है। कार्यप्रणाली के पक्ष और विपक्ष पर भी चर्चा की गई है।
Introduction
मधुमक्खियां (एपिस मेलिफेरा एल) अन्य जंगली परागणकों के बीच, कृषि पौधों के सबसे महत्वपूर्ण परागणक हैं। हजारों वर्षों में, बदलते पर्यावरण ने मधुमक्खियों को कई रोगजनकों और परजीवियों के लिए अपनी आकृति विज्ञान, शरीर विज्ञान, व्यवहार और सहिष्णुता को अनुकूलित करने के लिए प्रभावित किया है। इसलिए, मधुमक्खियोंने दुनिया भर में प्रजातियों और उप-प्रजातियों की एक अत्यधिक विविध श्रृंखला विकसित की है। ये परिणाम पिछले निष्कर्षों के अनुरूप हैं, कि मधुमक्खी के पाचन तंत्र की संरचना में आनुवंशिक भिन्नता है, लेकिन यह भी सुझाव देते हैं कि मिडगट के परिवर्तन पर्यावरणीयकारकों 2,3 के कारण हैं।
मधुमक्खी के पाचन तंत्र के तीन मुख्य भाग होते हैं: फोरगट, मिडगट (वेंट्रिकुलस), और हिंडगट4। वेंट्रिकुलस पराग और अमृत / शहद के पाचन के लिए एक आवश्यक अंग है; हिंडगट में, आसमाटिक नियंत्रण पानी और आयनों के अवशोषण के माध्यम से होताहै। मधुमक्खी श्रमिकों की हाइपोफैरेनजील ग्रंथियां (एचपीजी) सिर में स्थित होती हैं और ब्रूड, रानी और कॉलोनी के सदस्यों को खिलाने के लिए शाही जेली घटकों को संश्लेषित और स्रावित करती हैं। उनका आकार उम्र और कार्यों के साथ बदलता है और उचित पोषण (गुणवत्ता पराग) पर निर्भर करता है। 6 से 18 दिनों की आयु के नर्स कार्यकर्ता ब्रूड पालन करते हैं, और एचपीजी का आकार 5,6 बढ़ जाता है। फोरगर मधुमक्खियों में, एचपीजी पतित हो जाते हैं और केवल उन एंजाइमों का स्राव करते हैं जो जटिल शर्करा को सरल लोगों (α-ग्लूकोसिडेस, ल्यूसीन एरिलामिडेस, इनवर्टेस) में परिवर्तित करने के लिए महत्वपूर्णहोते हैं।
मधुमक्खियों को कई जैविक और अजैविक तनावों के संपर्क में लाया जाता है8, और पाचन तंत्र कई नकारात्मक उत्तेजक से प्रभावित हो सकता है। पहला अवरोध जो रोगजनकों से जीव की रक्षा करता है, वह मिडगट में पेरिट्रोफिक झिल्ली है, जिसमें रोगजनकों से बचाने के लिए आंतों का श्लेष्महोता है। एचपीजी का विकास और कार्य आहार, आयु और कॉलोनी की स्थिति9 पर निर्भर करता है, और कीटनाशकों, एक्रिसाइड्स 10 और रोगजनकों 11,12,13 से प्रभावित होता है। वरोआ नियंत्रण उपचार के कारण छत्ते में एकेरिसाइड अवशेष और पर्यावरण से कीटनाशक फोरगर मधुमक्खियों और नर्स मधुमक्खियों को प्रभावित करते हैं14,15. मधुमक्खी उपनिवेशों के लिए सबसे बड़ा खतरा घुन वरोआ विनाशक है, दोनों कॉलोनी के नुकसानमें योगदान देने वाले वायरस के वेक्टर के रूप में और मेजबान के वसा शरीर (मधुमक्खियों में एक महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण अंग) के उपभोक्ता के रूप में, जो परिणामस्वरूप व्यक्ति के शरीर और कॉलोनी कार्यों को प्रभावित करताहै।
हालांकि, गहन खेत आवास मधुमक्खियों के लिए अल्पकालिक खाद्य आपूर्ति प्रदान कर सकते हैं। इसलिए, कृषि-पर्यावरणीय योजनाओं को कृषि परिदृश्य में शहद केफूलों की उपलब्धता में वृद्धि करनी चाहिए। सेल या ऊतक स्तरों पर इन कारकों के विभिन्न उप-प्रजातियों 6,19,20,21 या उप-घातक प्रभावों का आकलन करने के लिए, हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विधियां व्यावहारिक और पर्याप्त रूप से सटीक हैं जिनका उपयोग मधुमक्खियों में हिस्टोलॉजी अनुसंधान में किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीवित जीवों में, कोशिका मृत्यु को एपोप्टोसिस या नेक्रोसिस25 के रूप में परिभाषित किया गया है और ऑटोफैगी26 के साथ हो सकता है। एपोप्टोटिक और नेक्रोटिक कोशिकाओं के बीच अंतर यह है कि एपोप्ट?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
मैं स्लोवेनियाई रिसर्च एजेंसी, अनुदान संख्या पी 4-133 के समर्थन को कृतज्ञता पूर्वक स्वीकार करता हूं।
Materials
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. . Naturgeschichte der Honigbienen. , (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. . The Anatomy of the Honey Bee. , (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. . Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M. Honey bee toxicology. Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, &. #. 2. 1. 4. ;. Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. . Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D’Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
