Technique d’injection d’embryons pour l’édition de gènes chez la tique à pattes noires, Ixodes scapularis
Summary
Le présent protocole décrit une méthode d’injection d’embryons de tiques. L’injection d’embryons est la technique préférée de manipulation génétique pour générer des lignées transgéniques.
Abstract
Les tiques peuvent transmettre divers agents pathogènes viraux, bactériens et protozoaires et sont donc considérées comme des vecteurs d’importance médicale et vétérinaire. Malgré le fardeau croissant des maladies transmises par les tiques, la recherche sur les tiques a pris du retard par rapport aux insectes vecteurs de maladies en raison des défis liés à l’application des outils de transformation génétique pour les études fonctionnelles à la biologie unique des tiques. Les interventions génétiques ont attiré l’attention pour réduire les maladies transmises par les moustiques. Cependant, le développement de telles interventions nécessite une transformation germinale stable par injection d’embryons. Une telle technique d’injection d’embryons fait défaut pour les chélicérates, y compris les tiques. Plusieurs facteurs, tels qu’une épaisse couche de cire externe sur les embryons de tiques, un chorion dur et une pression intra-ovale élevée, sont des obstacles qui empêchaient auparavant le développement du protocole d’injection d’embryons chez les tiques. Le présent travail a surmonté ces obstacles, et une technique d’injection d’embryons pour la tique à pattes noires, Ixodes scapularis, est décrite ici. Cette technique peut être utilisée pour fournir des composants, tels que CRISPR / Cas9, pour des transformations germinales stables.
Introduction
Les tiques sont des vecteurs d’importance médicale et vétérinaire, capables de transmettre une variété d’agents pathogènes viraux, bactériens, protozoaires et nématodes 1,2. Dans l’est des États-Unis, la tique à pattes noires, Ixodes scapularis, est un vecteur important de l’agent pathogène de la maladie de Lyme (ML), le spirochète Borrelia burgdorferi. Plus de 400 000 cas de ML sont signalés chaque année aux États-Unis, ce qui en fait la principale maladie infectieuse à transmission vectorielle aux États-Unis1. En plus de B. burgdorferi, six autres microorganismes sont transmis par I. scapularis, dont quatre bactéries (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi et Ehrlichia muris eauclarensis), un parasite protozoaire (Babesia microti) et un virus (virus Powassan), faisant de cette espèce de tique un problème majeur de santé publique3 . Alors que les maladies transmises par les tiques sont devenues plus répandues ces dernières années, la recherche sur les tiques a pris du retard par rapport à d’autres arthropodes vecteurs, tels que les moustiques, en raison de la biologie unique des tiques et des défis associés à l’application d’outils génétiques et génomiques fonctionnels 4,5.
Les techniques d’édition de gènes, en particulier CRISPR / Cas9, ont maintenant rendu les études de génomique fonctionnelle réalisables dans des organismes non modèles. Pour créer des mutations héréditaires dans un organisme, l’injection d’embryons reste la méthode préférée pour délivrer des constructions permettant de modifier la lignée germinale 6,7,8,9. Cependant, jusqu’à récemment4, les œufs de tiques étaient considérés comme trop difficiles ou même impossibles à injecter sans tuer l’embryon10,11. Une épaisse couche de cire sur les œufs, un chorion dur et une pression intra-ovale élevée étaient quelques-uns des principaux obstacles qui empêchaient l’injection d’embryons chez les tiques. I. scapularis adulte nourri au sang dépose une seule couvée de jusqu’à 2 000 œufs12 sur 3-4 semaines (environ 100 œufs / jour). Les œufs sont pondus individuellement, et chaque œuf est enrobé de cire sécrétée par les protubérances ou « cornes » de l’organe glandulaire de Gené13,14,15 de la mère. Cette cire protège les œufs de la dessiccation et contient des composés antimicrobiens15. Pour injecter avec succès des œufs de tiques, il est important d’enlever la couche de cire, de ramollir le chorion et de dessécher les œufs pour diminuer la pression intraovale afin que l’injection n’endommage pas irréversiblement l’œuf. Comprenant l’importance cruciale des injections d’embryons pour la transformation réussie de la lignée germinale, un protocole pour I. scapularis est développé, qui peut être utilisé pour délivrer une construction CRISPR / Cas9 et générer des mutations germinales stables4. En plus de sa contribution à la recherche sur I. scapularis, ce protocole pourrait également être optimisé pour d’autres espèces de tiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il s’agit du premier protocole développé pour injecter avec succès des embryons précoces de tiques. Un taux de survie de ~4%-8% a été atteint, ce qui est comparable à l’injection d’embryons dans d’autres modèles d’insectes bien établis5.
Comme il s’agit du protocole initial, on s’attend à ce que ce protocole soit affiné et spécialisé pour chaque espèce de tique. En particulier, le moment de l’injection variera d’une espèce à l’autre, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Channa Aluvihare et Yonus Gebermicale, ITF, UMD, pour leur perspicacité et leur soutien au cours de la phase initiale de développement du protocole. Les aiguilles en tungstène ont été généreusement offertes par David O’Brochta, ITF, UMD. Nous remercions le Dr Ladislav Simo d’avoir testé ce protocole dans I. ricinus et d’avoir eu des discussions perspicaces. Ce projet a été financé par NIH-NIAID R21AI128393 et Plymouth Hill Foundation, NY à MG-N, des fonds de démarrage de l’Université du Nevada à AN, la subvention n ° 2019609 de la National Science Foundation à MG-N et AN, et une subvention entre pairs de l’IGTRCN à AS.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
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