Embryo-Injektionstechnik zur Gen-Editierung bei der Schwarzbeinigen Zecke (Ixodes scapularis)
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Injektion von Zeckenembryonen. Die Embryoinjektion ist die bevorzugte Technik zur genetischen Manipulation, um transgene Linien zu erzeugen.
Abstract
Zecken können verschiedene virale, bakterielle und Protozoen-Erreger übertragen und gelten daher als Vektoren von medizinischer und veterinärmedizinischer Bedeutung. Trotz der wachsenden Belastung durch durch Zecken übertragene Krankheiten ist die Forschung an Zecken aufgrund von Herausforderungen bei der Anwendung genetischer Transformationswerkzeuge für funktionelle Studien auf die einzigartige Biologie von Zecken hinter Insektenkrankheitsvektoren zurückgeblieben. Genetische Interventionen haben Aufmerksamkeit erregt, um durch Moskitos übertragene Krankheiten zu reduzieren. Die Entwicklung solcher Interventionen erfordert jedoch eine stabile Keimbahntransformation durch Injektion von Embryonen. Eine solche Embryo-Injektionstechnik fehlt für Chelicerate, einschließlich Zecken. Mehrere Faktoren, wie eine äußere dicke Wachsschicht auf Zeckenembryonen, hartes Chorion und hoher intraovaler Druck, sind einige Hindernisse, die zuvor die Entwicklung des Embryoinjektionsprotokolls bei Zecken verhindert haben. Die vorliegende Arbeit hat diese Hindernisse überwunden, und eine Embryo-Injektionstechnik für die schwarzbeinige Zecke, Ixodes scapularis, wird hier beschrieben. Diese Technik kann verwendet werden, um Komponenten wie CRISPR / Cas9 für stabile Keimbahntransformationen zu liefern.
Introduction
Zecken sind Vektoren von medizinischer und veterinärmedizinischer Bedeutung, die in der Lage sind, eine Vielzahl von viralen, bakteriellen, Protozoenpathogenen und Nematoden zu übertragen 1,2. Im Osten der USA ist die schwarzbeinige Zecke Ixodes scapularis ein wichtiger Überträger des Erregers der Lyme-Borreliose (LD), der Spirochäte Borrelia burgdorferi. Über 400.000 Fälle von LD werden jedes Jahr in den Vereinigten Staaten gemeldet, was sie zur führenden vektorübertragenen Infektionskrankheit in den USA macht1. Neben B. burgdorferi werden sechs weitere Mikroorganismen durch I. scapularis übertragen, darunter vier Bakterien (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi und Ehrlichia muris eauclarensis), ein Protozoenparasit (Babesia microti) und ein Virus (Powassan-Virus), was diese Zeckenart zu einem großen Problem für die öffentliche Gesundheit macht3 . Während durch Zecken übertragene Krankheiten in den letzten Jahren häufiger geworden sind, ist die Forschung an Zecken aufgrund der einzigartigen Biologie der Zecken und der Herausforderungen im Zusammenhang mit der Anwendung genetischer und funktioneller genomischer Werkzeuge hinter andere Arthropodenvektoren wie Moskitos zurückgefallen 4,5.
Gen-Editing-Techniken, insbesondere CRISPR/Cas9, haben nun funktionelle Genomstudien an Nicht-Modellorganismen möglich gemacht. Um vererbbare Mutationen in einem Organismus zu erzeugen, bleibt die Embryoinjektion die bevorzugte Methode, um Konstrukte zur Veränderung der Keimbahn 6,7,8,9 zu liefern. Bis vor kurzem4 galten Zeckeneier jedoch als zu schwierig oder sogar unmöglich, sie zu injizieren, ohne den Embryo zu töten10,11. Eine dicke Wachsschicht auf Eiern, hartes Chorion und hoher intraovaler Druck waren einige der Haupthindernisse, die die Embryoinjektion in Zecken verhinderten. Erwachsene, blutgefütterte I. scapularis legen ein einzelnes Gelege von bis zu 2.000 Eiern12 über 3-4 Wochen ab (ca. 100 Eier / Tag). Die Eier werden einzeln gelegt, und jedes Ei ist mit Wachs überzogen, das durch Vorsprünge oder “Hörner” des DrüsenorgansGené 13,14,15 der Mutter abgesondert wird. Dieses Wachs schützt die Eier vor Austrocknung und enthält antimikrobielle Verbindungen15. Um Zeckeneier erfolgreich zu injizieren, ist es wichtig, die Wachsschicht zu entfernen, das Chorion zu erweichen und die Eier auszutrocknen, um den intraovalen Druck zu verringern, damit die Injektion das Ei nicht irreversibel beschädigt. Um die entscheidende Bedeutung von Embryoinjektionen für eine erfolgreiche Keimbahntransformation zu verstehen, wird ein Protokoll für I. scapularis entwickelt, das verwendet werden kann, um ein CRISPR/Cas9-Konstrukt zu liefern und stabile Keimbahnmutationen zu erzeugen4. Neben seinem Beitrag zur I. scapularis-Forschung könnte dieses Protokoll auch für andere Zeckenarten optimiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dies ist das erste Protokoll, das entwickelt wurde, um frühe Zeckenembryonen erfolgreich zu injizieren. Es wurde eine Überlebensrate von ~4%-8% erreicht, was mit der Embryoinjektion in anderen etablierten Insektenmodellen vergleichbar ist5.
Da dies das erste Protokoll ist, wird erwartet, dass dieses Protokoll weiter verfeinert und auf einzelne Zeckenarten spezialisiert wird. Insbesondere variiert der Injektionszeitpunkt von Art zu Art, abhängig von der Embryogenese, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Channa Aluvihare und Yonus Gebermicale, ITF, UMD, für Einblicke und Unterstützung in der Anfangsphase der Protokollentwicklung. Wolframnadeln waren ein großzügiges Geschenk von David O’Brochta, ITF, UMD. Wir danken Dr. Ladislav Simo für die Prüfung dieses Protokolls in I. ricinus und für aufschlussreiche Diskussionen. Dieses Projekt wurde von NIH-NIAID R21AI128393 und Plymouth Hill Foundation, NY to MG-N, Startkapital von der University of Nevada an AN, dem National Science Foundation Grant No. 2019609 an MG-N und AN und einem Peer-to-Peer Grant von IGTRCN an AS finanziert.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
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