Embryoinjeksjonsteknikk for genredigering i svartbenet flått, Ixodes scapularis
Summary
Denne protokollen beskriver en metode for injeksjon av flåttembryoer. Embryoinjeksjon er den foretrukne teknikken for genetisk manipulasjon for å generere transgene linjer.
Abstract
Flått kan overføre forskjellige virale, bakterielle og protozoiske patogener og betraktes derfor som vektorer av medisinsk og veterinær betydning. Til tross for den økende byrden av flåttbårne sykdommer, har forskning på flått ligget bak insektsykdomsvektorer på grunn av utfordringer med å anvende genetiske transformasjonsverktøy for funksjonelle studier til den unike biologien til flått. Genetiske inngrep har fått oppmerksomhet for å redusere myggbårne sykdommer. Utviklingen av slike inngrep krever imidlertid stabil kimlinjetransformasjon ved å injisere embryoer. En slik embryoinjeksjonsteknikk mangler for chelicerates, inkludert flått. Flere faktorer, for eksempel et eksternt tykt vokslag på flåttembryoer, hardkorion og høyt intra-ovalt trykk, er noen hindringer som tidligere forhindret embryoinjeksjonsprotokollutvikling i flått. Det foreliggende arbeidet har overvunnet disse hindringene, og en embryoinjeksjonsteknikk for svartbenet flått, Ixodes scapularis, er beskrevet her. Denne teknikken kan brukes til å levere komponenter, for eksempel CRISPR / Cas9, for stabile germline transformasjoner.
Introduction
Ticks er vektorer av medisinsk og veterinær betydning, som er i stand til å overføre en rekke virale, bakterielle, protozoiske patogener og nematoder 1,2. I det østlige USA er svartbenet kryss, Ixodes scapularis, en viktig vektor av Lyme-sykdommen (LD) patogen, spirochete Borrelia burgdorferi. Over 400 000 tilfeller av LD rapporteres hvert år i USA, noe som gjør den til den beste vektorbårne smittsomme sykdommen i USA1. I tillegg til B. burgdorferi overføres seks andre mikroorganismer av I. scapularis– inkludert fire bakterier (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi og Ehrlichia muris eauclarensis), en protozoa parasitt (Babesia microti) og ett virus (Powassan-virus), noe som gjør denne flåttarten til et stort folkehelseproblem3 . Mens flåttbårne sykdommer har blitt mer utbredt de siste årene, har forskning på flått falt bak andre leddyrvektorer, som mygg, på grunn av den unike biologien til flått og utfordringer forbundet med å anvende genetiske og funksjonelle genomiske verktøy 4,5.
Genredigeringsteknikker, spesielt CRISPR / Cas9, har nå gjort funksjonelle genomikkstudier gjennomførbare i ikke-modellorganismer. For å skape arvelige mutasjoner i en organisme, forblir embryoinjeksjon den foretrukne metoden for å levere konstruksjoner for å endre kimlinjen 6,7,8,9. Men inntil nylig4 ble flåttegg ansett som for vanskelig eller umulig å injisere uten å drepe embryoet10,11. Et tykt vokslag på egg, hardkorion og høyt intra-ovalt trykk var noen av de største hindringene som forhindret embryoinjeksjon i flått. Voksen, blodmatet I. scapularis deponerer en enkelt kobling på opptil 2000 egg12 over 3-4 uker (ca. 100 egg/dag). Egg legges enkeltvis, og hvert egg er belagt med voks som skilles ut ved fremspring eller “horn” av glandular Genés organ13,14,15 av moren. Denne voksen beskytter eggene mot uttørking og inneholder antimikrobielle forbindelser15. For å lykkes med å injisere kryssegg, er det viktig å fjerne vokslaget, myke korionen og tørke eggene for å redusere det intraovale trykket slik at injeksjonen ikke irreversibelt skader egget. For å forstå den kritiske betydningen av embryoinjeksjoner for vellykket germline-transformasjon, utvikles en protokoll for I. scapularis, som kan brukes til å levere en CRISPR / Cas9-konstruksjon og generere stabile germlinemutasjoner4. I tillegg til sitt bidrag til I. scapularis-forskning, kan denne protokollen også optimaliseres for andre flåttarter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette er den første protokollen utviklet for å injisere tidlige flåttembryoer vellykket. En overlevelsesrate på ~ 4% -8% er oppnådd, noe som kan sammenlignes med embryoinjeksjon i andre veletablerte insektmodeller5.
Siden dette er den første protokollen, forventes det at denne protokollen vil bli ytterligere raffinert og spesialisert til individuelle flåttarter. Spesielt vil injeksjonstidspunktet variere fra art til art, avhengig av embryogenese, spesielt tidspun…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner Channa Aluvihare og Yonus Gebermicale, ITF, UMD, for innsikt og støtte i den innledende fasen av protokollutviklingen. Wolframnåler var en sjenerøs gave fra David O’Brochta, ITF, UMD. Vi er takknemlige til Dr. Ladislav Simo for å teste denne protokollen i I. ricinus og for innsiktsfulle diskusjoner. Dette prosjektet ble finansiert av NIH-NIAID R21AI128393 og Plymouth Hill Foundation, NY til MG-N, oppstartsmidler fra University of Nevada til AN, National Science Foundation Grant No. 2019609 til MG-N og AN, og et Peer-to-Peer Grant fra IGTRCN til AS.
Materials
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).
- Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).
- Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Criscione, F., O'Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).
- Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).
- Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).
- Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).
- Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).
- Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene's organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).
- Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).
- Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gené's) organ in ixodid ticks. Tissue & Cell. 21 (1), 113-122 (1989).
- Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental & Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
