Isolatie van voorwaardelijk vereeuwigde glomerulaire endotheelcellen van de muis met fluorescerende mitochondriën
Summary
Het artikel beschrijft de methode voor het isoleren van voorwaardelijk onsterfelijke glomerulaire endotheelcellen uit de nieren van transgene muizen die het thermolabiele simianvirus 40 en foto-activeerbare mitochondriën tot expressie brengen, PhAMweggesneden. We beschrijven de procedure voor glomeruli-isolatie van hele nieren met behulp van kralen, spijsverteringsstappen, zaaien en kweken van GECs-CD31-positief.
Abstract
Glomerulaire endotheelcel (GEC) disfunctie kan glomerulaire filtratiebarrièreafbraak initiëren en eraan bijdragen. Verhoogde mitochondriale oxidatieve stress is gesuggereerd als een mechanisme dat resulteert in GEC-disfunctie in de pathogenese van sommige glomerulaire ziekten. Historisch gezien is de isolatie van GEC’s van in vivo modellen notoir uitdagend vanwege moeilijkheden bij het isoleren van zuivere culturen uit glomeruli. GEC’s hebben complexe groeivereisten in vitro en een zeer beperkte levensduur. Hier beschrijven we de procedure voor het isoleren en cultiveren van voorwaardelijk vereeuwigde GEC’s met fluorescerende mitochondriën, waardoor mitochondriale splijting en fusiegebeurtenissen kunnen worden gevolgd. GEC’s werden geïsoleerd uit de nieren van een dubbele transgene muis die de thermolabiele SV40 TAg (van de Immortomouse) tot expressie bracht, voorwaardelijk proliferatie bevorderde en celdifferentiatie onderdrukte, en een foto-converteerbaar fluorescerend eiwit (Dendra2) in alle mitochondriën (van de foto-activeerbare mitochondriën [PhAMweggesneden] muis). De gegenereerde stabiele cellijn maakt celdifferentiatie mogelijk na inactivatie van het vereeuwigende SV40 TAg-gen en fotoactivering van een subset van mitochondriën die een omschakeling in fluorescentie van groen naar rood veroorzaken. Het gebruik van mitoDendra2-GEC’s maakt live beeldvorming mogelijk van de distributie, fusie en splijting van fluorescerende mitochondriën zonder de cellen te kleuren.
Introduction
De glomerulus is van cruciaal belang voor bloedfiltratie door de doorgang van grote moleculen door de glomerulaire filtratiebarrièrete beperken 1,2. De glomerulus bevat vier celtypen: pariëtale epitheelcellen, podocyten (viscerale epitheelcellen), glomerulaire endotheelcellen (GEC) en mesangiale cellen3. Het glomerulaire endotheel wordt gekenmerkt door een unieke vasculaire structuur, volgens de aanwezigheid van fenestrae die nodig is voor grote filtratievolumes4. Het apicale oppervlak van het glomerulaire endotheel is bedekt met een negatief geladen glycocalyxlaag en een laag die de endotheeloppervlaklaag wordt genoemd en die een ruimte creëert tussen het endotheel en bloed. Deze structuur biedt een selectiviteit met een hoge lading die de doorgang van negatief geladen moleculen zoals albumine beperkt en leukocyten- en bloedplaatjesadhesievoorkomt 5.
GEC’s zijn erg gevoelig voor metabole veranderingen, zoals de hyperglycemie geassocieerd met het diabetische milieu. Inderdaad, diabetes leidt tot een verhoogde circulatie van schadelijke stoffen, de verzadiging van glucosemetabolismeroutes en een verstoorde cellulaire redoxbalans 3,6. Bovendien induceert de toename van reactieve zuurstofsoorten mitochondriale disfunctie, die de endotheelfunctie beïnvloedt7.
Het algemene doel van het huidige protocol is om onsterfelijk gemaakte glomerulaire endotheelcellen te isoleren met fluorescerende mitochondriale kenmerken. Inderdaad, de celcultuur van primaire GEC’s heeft een beperkte proliferatieve cyclus en vroege senescentie8. Bovendien helpt de aanwezigheid van fluorescerende mitochondriën bij het onderzoeken van splijtings- en fusiegebeurtenissen als reactie op hyperglykemie of een andere behandeling. Als alternatieve methode gebruikten andere laboratoria h-TERT om cellen in vitro te vereeuwigen 9.
De hier beschreven methode maakt de isolatie mogelijk van voorwaardelijk vereeuwigde mitoDendra2 glomerulaire endotheelcellen van 4-6 weken oude dieren (figuur 1). Dit gedetailleerde protocol beschrijft het gebruik van transgene muizen (H-2K b-tsA58) die het simian virus 40 large tumor antigen (SV40 TAg) gen10,11 herbergen voor het genereren van thermolabiele voorwaardelijk vereeuwigde cellen. Het tsA58 TAg-genproduct is functioneel bij de permissieve temperatuur van 33 °C onder controle van de induceerbare 5′-flankerende promotor van het H-2Kb-gen van de muis, dat bij blootstelling aan interferongamma (IFNγ) boven basale niveaus wordt verhoogd, waardoor het voorwaardelijke proliferatiefenotype12 behouden blijft. H-2Kb wordt snel afgebroken bij de niet-permissieve temperatuur van 37 °C in afwezigheid van IFNγ, waardoor de onsterfelijkheidsfunctie van de tsA58Tag in cellen wordt verwijderd en de cellen een meer gedifferentieerd fenotype 13,14,15 kunnen ontwikkelen. Optionele kruising van H-2Kb-tsA58 transgene muizen met PhAM-muizen, die een mitochondria-specifieke (subeenheid VIII van cytochroom c-oxidase) Dendra2-green tot expressie brengen, maakt de live detectie van fluorescerende mitochondriënmogelijk 16. Dendra2 groene fluorescentie schakelt over naar rode fluorescentie na blootstelling aan een 405 nm laser16. Wanneer mitochondriën fuseren na het wisselen van foto’s, vormen ze langwerpige vormen die geel lijken door de uitwisseling van groen en geel materiaal of rood lijken wanneer ze splijting ondergaan 7,17. De mitoDendra2-GEC’s zijn een geweldig hulpmiddel voor het bestuderen van de cellulaire reacties van GEC-mitochondriën op verschillende stimuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitochondriën zijn van cruciaal belang voor cellulair metabolisme, homeostase en stressreacties, en hun disfunctie is gekoppeld aan vele ziekten, waaronder nierziekten. Mitochondriën spelen een rol bij de pathologische generatie van overmatige reactieve zuurstofsoorten (ROS), de regulatie van intracellulaire calciumspiegels, celdoodroutes en cytoskeletale dynamica 21,22,23.
De isolatie van muizengel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken professor Cijiang He en Dr. Fu Jia voor hun inzichten in muizen endotheelcelisolatie en bedanken professor Mone Zaidi voor het verstrekken van dePhAM-weggesneden muizen en waardevolle discussies. De auteurs willen ook de Microscopie CORE aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï en het personeel bedanken voor de begeleiding die we hebben ontvangen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van National Institutes of Health grant R01DK097253 en Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 aan I.S.D.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
