Isolering af betinget udødeliggjorte museglomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondrier
Summary
Artiklen beskriver metoden til isolering af betinget udødeliggjorte glomerulære endotelceller fra nyrerne hos transgene mus, der udtrykker den termolabile simianvirus 40 og fotoaktiverbare mitokondrier, PhAMudskåret. Vi beskriver proceduren for glomeruli-isolering fra hele nyrer ved hjælp af perler, fordøjelsestrin, såning og dyrkning af GECs-CD31-positive.
Abstract
Glomerulær endotelcelle (GEC) dysfunktion kan initiere og bidrage til glomerulær filtreringsbarrierenedbrydning. Øget mitokondriel oxidativ stress er blevet foreslået som en mekanisme, der resulterer i GEC-dysfunktion i patogenesen af nogle glomerulære sygdomme. Historisk set har isoleringen af GEC’er fra in vivo-modeller været notorisk udfordrende på grund af vanskeligheder med at isolere rene kulturer fra glomeruli. GEC’er har komplekse vækstkrav in vitro og en meget begrænset levetid. Her beskriver vi proceduren for isolering og dyrkning betinget udødeliggjorte GEC’er med fluorescerende mitokondrier, hvilket muliggør sporing af mitokondriefission og fusionshændelser. GEC’er blev isoleret fra nyrerne hos en dobbelt transgen mus, der udtrykte den termolabile SV40 TAg (fra Immortomouse), betinget fremme proliferation og undertrykkelse af celledifferentiering og et fotokonvertibelt fluorescerende protein (Dendra2) i alle mitokondrier (fra den fotoaktiverbare mitokondrier [PhAMudskåret] mus). Den genererede stabile cellelinje giver mulighed for celledifferentiering efter inaktivering af det udødeliggørende SV40 TAg-gen og fotoaktivering af en delmængde af mitokondrier, der forårsager en skift i fluorescens fra grøn til rød. Brugen af mitoDendra2-GEC’er giver mulighed for levende billeddannelse af fluorescerende mitokondriers fordeling, fusion og fissionshændelser uden at farve cellerne.
Introduction
Glomerulus er kritisk for blodfiltrering ved at begrænse passagen af store molekyler gennem den glomerulære filtreringsbarriere 1,2. Glomerulus indeholder fire celletyper: parietale epitelceller, podocytter (viscerale epitelceller), glomerulære endotelceller (GEC) og mesangialceller3. Det glomerulære endotel er kendetegnet ved en unik vaskulær struktur i henhold til tilstedeværelsen af fenestrae, der kræves til store filtreringsvolumener4. Den apikale overflade af det glomerulære endotel er dækket af et negativt ladet glycocalyxlag og et lag kaldet endoteloverfladelaget, der skaber et mellemrum mellem endotelet og blodet. Denne struktur tilvejebringer høj ladningsselektivitet, der begrænser passagen af negativt ladede molekyler såsom albumin og forhindrer leukocyt- og blodpladeadhæsion5.
GEC’er er meget følsomme over for metaboliske ændringer, såsom hyperglykæmi forbundet med diabetisk miljø. Faktisk fører diabetes til øget cirkulation af skadelige stoffer, mætning af glukosemetabolismeveje og forstyrret cellulær redoxbalance 3,6. Desuden inducerer stigningen i reaktive iltarter mitokondriel dysfunktion, som påvirker endotelfunktionen7.
Det overordnede mål med den nuværende protokol er at isolere udødeliggjorte glomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondriefunktioner. Faktisk har cellekulturen af primære GEC’er en begrænset proliferativ cyklus og tidlig ældning8. Derudover hjælper tilstedeværelsen af fluorescerende mitokondrier med at undersøge fissions- og fusionshændelser som reaktion på hyperglykæmi eller anden behandling. Som en alternativ metode brugte andre laboratorier h-TERT til at udødeliggøre celler in vitro9.
Metoden beskrevet her tillader isolering af betinget udødeliggjort mitoDendra2 glomerulære endotelceller fra 4-6 uger gamle dyr (figur 1). Denne detaljerede protokol beskriver brugen af transgene mus (H-2K b-tsA58), der huser simianvirus 40 stort tumorantigen (SV40 TAg) gen10,11 til generering af termolabile betinget udødeliggjorte celler. TsA58 TAg-genproduktet er funktionelt ved den tilladte temperatur på 33 °C under kontrol af den inducerbare 5′ flankerende promotor af musens H-2Kb-gen, som øges over basale niveauer ved eksponering for interferon gamma (IFNγ), og opretholder derfor den betingede proliferationsfænotype12. H-2Kb nedbrydes hurtigt ved den ikke-tilladte temperatur på 37 °C i fravær af IFNγ, hvilket fjerner den udødeliggørende funktion af tsA58Tag i celler og gør det muligt for cellerne at udvikle en mere differentieret fænotype13,14,15. Valgfri krydsning af H-2Kb-tsA58 transgene mus med PhAM-mus, som udtrykker en mitokondrie-specifik (underenhed VIII af cytokrom c oxidase) Dendra2-grøn, tillader levende påvisning af fluorescerende mitokondrier16. Dendra2 grøn fluorescens skifter til rød fluorescens efter eksponering for en 405 nm laser16. Når mitokondrier smelter sammen efter fotoskift, danner de aflange former, der ser gule ud fra udveksling af grønt og gult materiale eller ser røde ud, når de gennemgår fission 7,17. MitoDendra2-GEC’erne er et godt værktøj til at studere de cellulære reaktioner fra GEC-mitokondrier på forskellige stimuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrier er kritiske for cellulær metabolisme, homeostase og stressrespons, og deres dysfunktion er forbundet med mange sygdomme, herunder nyresygdom. Mitokondrier har en rolle i den patologiske generering af overdreven reaktiv iltart (ROS), reguleringen af intracellulære calciumniveauer, celledødsveje og cytoskeletal dynamik21,22,23.
Isoleringen af murine GEC’er er udfordrende på grund af der…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker professor Cijiang He og Dr. Fu Jia for deres indsigt i museendotelcelleisolering og takker professor Mone Zaidi for at givePhAM-udskårne mus og værdifulde diskussioner. Forfatterne vil også gerne anerkende mikroskopi CORE på Icahn School of Medicine på Mount Sinai og personale for den vejledning, vi modtog. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health grant R01DK097253 og Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 til I.S.D.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
