फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सशर्त रूप से अमर माउस ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव
Summary
लेख ट्रांसजेनिक चूहों के गुर्दे से सशर्त रूप से अमर ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने की विधि का वर्णन करता है जो थर्मोलेबिल सिमियन वायरस 40 और फोटो-एक्टिवेबल माइटोकॉन्ड्रिया, पीएचएएमएक्साइज्ड को व्यक्त करता है। हम मोतियों, पाचन चरणों, बीजारोपण और जीईसी-सीडी 31 पॉजिटिव के संवर्धन का उपयोग करके पूरे गुर्दे से ग्लोमेरुली अलगाव की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।
Abstract
ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल सेल (जीईसी) डिसफंक्शन ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा टूटने में शुरू और योगदान कर सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि को एक तंत्र के रूप में सुझाया गया है जिसके परिणामस्वरूप कुछ ग्लोमेरुलर रोगों के रोगजनन में जीईसी शिथिलता होती है। ऐतिहासिक रूप से विवो मॉडल से जीईसी का अलगाव ग्लोमेरुली से शुद्ध संस्कृतियों को अलग करने में कठिनाइयों के कारण कुख्यात रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। जीईसी में विट्रो में जटिल विकास आवश्यकताएं हैं और बहुत सीमित जीवनकाल है। यहां, हम फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सशर्त रूप से अमर जीईसी को अलग करने और संवर्धन करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जिससे माइटोकॉन्ड्रियल विखंडन और संलयन घटनाओं की ट्रैकिंग सक्षम होती है। जीईसी को एक डबल ट्रांसजेनिक माउस के गुर्दे से अलग किया गया था जो थर्मोलेबिल एसवी 40 टीएजी (इम्मोर्टोमोज़ से), सशर्त रूप से प्रसार को बढ़ावा देता है और सेल भेदभाव को दबाता है, और सभी माइटोकॉन्ड्रिया में एक फोटो-परिवर्तनीय फ्लोरोसेंट प्रोटीन (डेंडर 2) (फोटो-एक्टिवेबल माइटोकॉन्ड्रिया [पीएचएएमएक्साइज्ड] माउस से)। उत्पन्न स्थिर सेल लाइन अमर एसवी 40 टीएजी जीन की निष्क्रियता और माइटोकॉन्ड्रिया के उप-समूह के फोटो-सक्रियण के बाद सेल भेदभाव की अनुमति देती है जिससे हरे से लाल रंग में प्रतिदीप्ति में स्विच होता है। MitoDendra2-GECs का उपयोग कोशिकाओं को धुंधला किए बिना फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया के वितरण, संलयन और विखंडन घटनाओं की लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है।
Introduction
ग्लोमेरुलस ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा 1,2 के माध्यम से बड़े अणुओं के पारित होने को प्रतिबंधित करके रक्त निस्पंदन के लिए महत्वपूर्ण है। ग्लोमेरुलस में चार सेल प्रकार होते हैं: पार्श्विका उपकला कोशिकाएं, पोडोसाइट्स (आंत उपकला कोशिकाएं), ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (जीईसी), और मेसंगियल कोशिकाएं3। ग्लोमेरुलर एंडोथेलियम को एक अद्वितीय संवहनी संरचना की विशेषता है, बड़े निस्पंदन वॉल्यूम4 के लिए आवश्यक फेनेस्ट्री की उपस्थिति के अनुसार। ग्लोमेरुलर एंडोथेलियम की एपिकल सतह एक नकारात्मक रूप से चार्ज ग्लाइकोकैलिक्स परत और एंडोथेलियल सतह परत नामक एक कोट से ढकी होती है जो एंडोथेलियम और रक्त के बीच एक जगह बनाती है। यह संरचना एल्बुमिन जैसे नकारात्मक रूप से चार्ज अणुओं के पारित होने को प्रतिबंधित करने और ल्यूकोसाइट और प्लेटलेट आसंजन को रोकने के लिए उच्च चार्ज चयनात्मकता प्रदान करतीहै।
जीईसी चयापचय परिवर्तनों के प्रति बहुत संवेदनशील होते हैं, जैसे कि मधुमेह के वातावरण से जुड़े हाइपरग्लेसेमिया। दरअसल, मधुमेह हानिकारक पदार्थों के परिसंचरण में वृद्धि, ग्लूकोज चयापचय मार्गों की संतृप्ति और परेशान सेलुलर रेडॉक्स संतुलन 3,6 की ओर जाता है। इसके अलावा, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में वृद्धि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन को प्रेरित करती है, जो एंडोथेलियल फ़ंक्शन 7 को प्रभावित करतीहै।
वर्तमान प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल विशेषताओं के साथ अमर ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करना है। दरअसल, प्राथमिक जीईसी की सेल संस्कृति में एक सीमित प्रोलिफेरेटिव चक्र और प्रारंभिक शिथिलता8 है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया की उपस्थिति हाइपरग्लेसेमिया या किसी अन्य उपचार के जवाब में विखंडन और संलयन घटनाओं की जांच करने में मदद करती है। एक वैकल्पिक विधि के रूप में, अन्य प्रयोगशालाओं ने विट्रो9 में कोशिकाओं को अमर करने के लिए एच-टीआरटी का उपयोग किया।
यहां वर्णित विधि 4-6 सप्ताह के जानवरों से सशर्त रूप से अमर माइटोडेंद्र 2 ग्लोमेरुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देती है (चित्रा 1)। यह विस्तृत प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक चूहों (एच -2 केबी-टीएसए 58) के उपयोग का वर्णन करता है जो थर्मोलेबिल सशर्त रूप से अमर कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए सिमियन वायरस 40 बड़े ट्यूमर एंटीजन (एसवी 40 टीएजी) जीन 10,11 को आश्रय देता है। टीएसए 58 टीएजी जीन उत्पाद माउस एच -2 केबी जीन के इंड्यूसेबल 5 ‘फ्लैंकिंग प्रमोटर के नियंत्रण में 33 डिग्री सेल्सियस के अनुमेय तापमान पर कार्यात्मक है, जो इंटरफेरॉन गामा (आईएफएन) के संपर्क में आने पर बेसल स्तर से ऊपर बढ़ जाता है, इसलिए सशर्त प्रसार फेनोटाइप12 को बनाए रखता है। एच -2 केबी आईएफएन की अनुपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस के गैर-अनुमेय तापमान पर तेजी से अवक्रमित होता है, कोशिकाओं में टीएसए 58 टैग के अमर कार्य को हटा देता है और कोशिकाओं को अधिक विभेदित फेनोटाइप 13,14,15 विकसित करने की अनुमति देता है। पीएचएएम चूहों के साथ एच -2 केबी-टीएसए 58 ट्रांसजेनिक चूहों का वैकल्पिक क्रॉसिंग, जो माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट (साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज के सबयूनिट VIII) डेंडर 2-ग्रीन को व्यक्त करता है, फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रिया16 का लाइव पता लगाने की अनुमति देता है। 405 एनएम लेजर16 के संपर्क में आने के बाद डेंड्रा 2 ग्रीन फ्लोरेसेंस लाल फ्लोरेसेंस में बदल जाता है। जब माइटोकॉन्ड्रिया फोटो-स्विचिंग के बाद फ्यूज होते हैं, तो वे लम्बी आकृतियों का निर्माण करते हैं जो हरे और पीले पदार्थ के आदान-प्रदान से पीले दिखाई देते हैं या विखंडन7,17 से गुजरने पर लाल दिखाई देते हैं। मिटोडेंड्रा 2-जीईसी विभिन्न उत्तेजनाओं के लिए जीईसी माइटोकॉन्ड्रिया की सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक महान उपकरण हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर चयापचय, होमियोस्टैसिस और तनाव प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं, और उनकी शिथिलता गुर्दे की बीमारी सहित कई बीमारियों से जुड़ी हुई है। माइटोकॉन्ड्रिया की अत्यधिक प्रतिक्रि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने प्रोफेसर सिजियांग हे और डॉ फू जिया को चूहों एंडोथेलियल सेल अलगाव में उनकी अंतर्दृष्टि के लिए धन्यवाद दिया और प्रोफेसर मोने जैदी को पीएचएएमउत्पादित चूहों और मूल्यवान चर्चाओं को प्रदान करने के लिए धन्यवाद दिया। लेखक माउंट सिनाई में इकान स्कूल ऑफ मेडिसिन में माइक्रोस्कोपी कोर और हमें प्राप्त मार्गदर्शन के लिए कर्मचारियों को भी स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान R01DK097253 और रक्षा विभाग CDMRP अनुदान E01 W81XWH2010836 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
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