Isolering av betinget udødeliggjorte museglomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondrier
Summary
Artikkelen beskriver metoden for å isolere betinget immortaliserte glomerulære endotelceller fra nyrene til transgene mus som uttrykker termolabile simian virus 40 og fotoaktiverbare mitokondrier, PhAMskåret ut. Vi beskriver prosedyren for glomeruli-isolasjon fra hele nyrer ved hjelp av perler, fordøyelsestrinn, såing og dyrking av GECs-CD31 positiv.
Abstract
Glomerulær endotelcelledysfunksjon (GEC) kan initiere og bidra til nedbrytning av glomerulær filtreringsbarriere. Økt mitokondriell oksidativt stress har blitt foreslått som en mekanisme som resulterer i GEC dysfunksjon i patogenesen av noen glomerulære sykdommer. Historisk sett har isolasjonen av GECs fra in vivo-modeller vært notorisk utfordrende på grunn av vanskeligheter med å isolere rene kulturer fra glomeruli. GEC-er har komplekse vekstkrav in vitro og en svært begrenset levetid. Her beskriver vi prosedyren for isolering og dyrking av betinget udødeliggjorte GEC-er med fluorescerende mitokondrier, noe som muliggjør sporing av mitokondrielle fisjons- og fusjonshendelser. GEC ble isolert fra nyrene til en dobbel transgen mus som uttrykker termolabil SV40 TAg (fra Immortomouse), betinget fremme proliferasjon og undertrykke celledifferensiering, og et fotokonvertibelt fluorescerende protein (Dendra2) i alle mitokondrier (fra fotoaktiverbar mitokondrier [PhAMskåret ut] mus). Den stabile cellelinjen som genereres tillater celledifferensiering etter inaktivering av det immortaliserende SV40 TAg-genet og fotoaktivering av en delmengde mitokondrier som forårsaker en bryter i fluorescens fra grønn til rød. Bruken av mitoDendra2-GECs muliggjør levende avbildning av fluorescerende mitokondriers distribusjon, fusjon og fisjonshendelser uten å farge cellene.
Introduction
Glomerulus er kritisk for blodfiltrering ved å begrense passasjen av store molekyler gjennom glomerulær filtreringsbarriere 1,2. Glomerulus inneholder fire celletyper: parietale epitelceller, podocytter (viscerale epitelceller), glomerulære endotelceller (GEC) og mesangialceller3. Det glomerulære endotelet er preget av en unik vaskulær struktur, i henhold til tilstedeværelsen av fenestrae som kreves for store filtreringsvolumer4. Den apikale overflaten av det glomerulære endotelet er dekket med et negativt ladet glykokalyxlag og et lag kalt endoteloverflatelaget som skaper et mellomrom mellom endotelet og blodet. Denne strukturen gir høy ladningsselektivitet som begrenser passasjen av negativt ladede molekyler som albumin og forhindrer leukocytt- og blodplateadhesjon5.
GEC er svært følsomme for metabolske endringer, for eksempel hyperglykemi forbundet med diabetisk miljø. Faktisk fører diabetes til økt sirkulasjon av skadelige stoffer, metning av glukosemetabolismeveier og forstyrret cellulær redoksbalanse 3,6. Videre induserer økningen i reaktive oksygenarter mitokondriell dysfunksjon, noe som påvirker endotelfunksjonen7.
Det overordnede målet med den nåværende protokollen er å isolere udødelige glomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondrielle egenskaper. Faktisk har cellekulturen til primære GEC-er en begrenset proliferativ syklus og tidlig aldring8. I tillegg bidrar tilstedeværelsen av fluorescerende mitokondrier til å undersøke fisjons- og fusjonshendelser som respons på hyperglykemi eller annen behandling. Som en alternativ metode brukte andre laboratorier h-TERT for å udødeliggjøre celler in vitro9.
Metoden beskrevet her tillater isolering av betinget udødelige mitoDendra2 glomerulære endotelceller fra 4-6 uker gamle dyr (figur 1). Denne detaljerte protokollen beskriver bruken av transgene mus (H-2K b-tsA58) som inneholder simian virus 40 large tumor antigen (SV40 TAg) genet10,11 for å generere termolabile betinget udødeliggjorte celler. TSA58 TAg-genproduktet er funksjonelt ved den tillatte temperaturen på 33 °C under kontroll av den induserbare 5′ flankerende promotoren av musens H-2Kb-gen, som økes over basale nivåer ved eksponering for interferon gamma (IFNγ), og opprettholder derfor den betingede proliferasjonsfenotypen12. H-2Kb nedbrytes raskt ved den ikke-permissive temperaturen på 37 °C i fravær av IFNγ, noe som fjerner den immortaliserende funksjonen til tsA58Tag i celler og lar cellene utvikle en mer differensiert fenotype13,14,15. Valgfri kryssing av H-2Kb-tsA58 transgene mus med PhAM-mus, som uttrykker en mitokondrie-spesifikk (underenhet VIII av cytokrom c-oksidase) Dendra2-grønn, tillater levende deteksjon av fluorescerende mitokondrier16. Dendra2 grønn fluorescens bytter til rød fluorescens etter eksponering for en 405 nm laser16. Når mitokondrier smelter sammen etter fotobytte, danner de langstrakte former som ser gule ut fra utvekslingen av grønt og gult materiale eller ser røde ut når de gjennomgår fisjon 7,17. MitoDendra2-GECs er et flott verktøy for å studere de cellulære responsene til GEC-mitokondrier til forskjellige stimuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrier er kritiske for cellulær metabolisme, homeostase og stressresponser, og deres dysfunksjon er knyttet til mange sykdommer, inkludert nyresykdom. Mitokondrier har en rolle i patologisk generering av overdreven reaktive oksygenarter (ROS), regulering av intracellulære kalsiumnivåer, celledødsveier og cytoskeletal dynamikk21,22,23.
Isoleringen av murine GEC er utfordrende på grunn av der…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker professor Cijiang He og Dr. Fu Jia for deres innsikt i musens endotelcelleisolasjon og takker professor Mone Zaidi for å gi PhAMutskårne mus og verdifulle diskusjoner. Forfatterne vil også gjerne anerkjenne Microscopy CORE ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai og ansatte for veiledningen vi mottok. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health grant R01DK097253 og Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 til I.S.D.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
