Isolamento de células endoteliais glomerulares de camundongos imortalizadas condicionalmente com mitocôndrias fluorescentes
Summary
O artigo descreve o método de isolamento de células endoteliais glomerulares imortalizadas condicionalmente dos rins de camundongos transgênicos expressando o vírus símio termolábil 40 e mitocôndrias fotoativáveis,excisadas por PhAM. Descrevemos o procedimento para isolamento de glomérulos de rins inteiros usando contas, etapas de digestão, semeadura e cultura de GECs-CD31 positivos.
Abstract
A disfunção das células endoteliais glomerulares (GEC) pode iniciar e contribuir para a quebra da barreira de filtração glomerular. O aumento do estresse oxidativo mitocondrial tem sido sugerido como um mecanismo que resulta em disfunção GEC na patogênese de algumas doenças glomerulares. Historicamente, o isolamento dos GECs dos modelos in vivo tem sido notoriamente desafiador devido às dificuldades em isolar culturas puras dos glomérulos. Os GECs têm requisitos complexos de crescimento in vitro e uma vida útil muito limitada. Aqui, descrevemos o procedimento de isolamento e cultura de GECs condicionalmente imortalizados com mitocôndrias fluorescentes, possibilitando o rastreamento de eventos de fissão e fusão mitocondriais. Os GECs foram isolados dos rins de um camundongo duplo transgênico expressando o TAg termolábil SV40 (do camundongo Immorto), promovendo condicionalmente a proliferação e suprimindo a diferenciação celular, e uma proteína fluorescente fotoconversível (Dendra2) em todas as mitocôndrias (do camundongo mitocôndrias fotoativáveis [PhAMexcised]). A linhagem celular estável gerada permite a diferenciação celular após a inativação do gene imortalizante SV40 TAg e a fotoativação de um subconjunto de mitocôndrias, causando uma mudança na fluorescência do verde para o vermelho. O uso de mitoDendra2-GECs permite imagens ao vivo dos eventos de distribuição, fusão e fissão das mitocôndrias fluorescentes sem corar as células.
Introduction
O glomérulo é crítico para a filtração sanguínea, restringindo a passagem de moléculas grandes através da barreira de filtração glomerular 1,2. O glomérulo contém quatro tipos de células: células epiteliais parietais, podócitos (células epiteliais viscerais), células endoteliais glomerulares (GEC) e células mesangiais3. O endotélio glomerular é caracterizado por uma estrutura vascular única, de acordo com a presença de fenestras necessárias para grandes volumes de filtração4. A superfície apical do endotélio glomerular é coberta com uma camada de glicocálice carregada negativamente e uma camada chamada camada superficial endotelial que cria um espaço entre o endotélio e o sangue. Essa estrutura proporciona alta seletividade de carga, restringindo a passagem de moléculas carregadas negativamente, como a albumina, e prevenindo a adesão de leucócitos e plaquetas5.
Os GECs são muito sensíveis a alterações metabólicas, como a hiperglicemia associada ao meio diabético. De fato, o diabetes leva ao aumento da circulação de substâncias nocivas, à saturação das vias metabólicas da glicose e à perturbação do equilíbrio redox celular 3,6. Além disso, o aumento das espécies reativas de oxigênio induz disfunção mitocondrial, o que afeta a função endotelial7.
O objetivo geral do protocolo atual é isolar células endoteliais glomerulares imortalizadas com características mitocondriais fluorescentes. De fato, a cultura celular de GECs primários tem um ciclo proliferativo limitado e senescência precoce8. Além disso, a presença de mitocôndrias fluorescentes ajuda a examinar eventos de fissão e fusão em resposta à hiperglicemia ou a qualquer outro tratamento. Como método alternativo, outros laboratórios utilizaram o h-TERT para imortalizar células in vitro9.
O método aqui descrito permite o isolamento de células endoteliais mitoDendra2 imortalizadas condicionalmente de animais de 4 a 6 semanas de idade (Figura 1). Este protocolo detalhado descreve o uso de camundongos transgênicos (H-2K b-tsA58) abrigando o vírus símio 40 grande antígeno tumoral (SV40 TAg) gene10,11 para a geração de células termolábeis condicionalmente imortalizadas. O produto do gene tsA58 TAg é funcional à temperatura permissiva de 33 °C sob o controle do promotor de flanco induzível de 5′ do gene H-2Kb do camundongo, que é aumentado acima dos níveis basais após a exposição ao interferon gama (IFNγ), mantendo, portanto, o fenótipo de proliferação condicional12. O H-2Kb é rapidamente degradado à temperatura não permissiva de 37 °C na ausência de IFNγ, removendo a função imortalizante do tsA58Tag nas células e permitindo que as células desenvolvam um fenótipo mais diferenciado13,14,15. O cruzamento opcional de camundongos transgênicos H-2Kb-tsA58 com camundongos PhAM, que expressam uma Dendra2-verde específica para mitocôndrias (subunidade VIII da citocromo c oxidase), permite a detecção ao vivo de mitocôndrias fluorescentes16. A fluorescência verde Dendra2 muda para fluorescência vermelha após a exposição a um laser de 405 nm16. Quando as mitocôndrias se fundem após a fotocomutação, formam formas alongadas que aparecem amarelas pela troca de material verde e amarelo ou aparecem vermelhas quando sofrem fissão 7,17. Os mitoDendra2-GECs são uma ótima ferramenta para estudar as respostas celulares das mitocôndrias GEC a diferentes estímulos.
Protocol
Representative Results
Discussion
As mitocôndrias são críticas para o metabolismo celular, homeostase e respostas ao estresse, e sua disfunção está ligada a muitas doenças, incluindo doenças renais. As mitocôndrias têm papel na geração patológica de espécies reativas excessivas de oxigênio (EROs), na regulação dos níveis intracelulares de cálcio, nas vias de morte celular e na dinâmica citoesquelética21,22,23.
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Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Professor Cijiang He e ao Dr. Fu Jia por seus insights sobre o isolamento de células endoteliais de camundongos e agradecem ao Professor Mone Zaidi por fornecer aos camundongosexcisados PhAM e discussões valiosas. Os autores também gostariam de agradecer o CORE de Microscopia na Escola de Medicina Icahn no Monte Sinai e a equipe pela orientação que recebemos. Este trabalho foi apoiado por doações do subsídio R01DK097253 do National Institutes of Health e do subsídio CDMRP do Departamento de Defesa E01 W81XWH2010836 ao I.S.D.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
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