Выделение условно увековеченных мышиных клубочковых эндотелиальных клеток с флуоресцентными митохондриями
Summary
В статье описан способ выделения условно увековеченных клубочковых эндотелиальных клеток из почек трансгенных мышей, экспрессирующих термолабильный обезьяний вирус 40 и фотоактивируемых митохондрий,иссекенных PhAM. Описана процедура выделения клубочков из цельных почек с помощью шариков, стадий пищеварения, посева и культивирования GECs-CD31-положительных.
Abstract
Дисфункция клубочковых эндотелиальных клеток (GEC) может инициировать и способствовать разрушению клубочкового фильтрационного барьера. Повышенный митохондриальный окислительный стресс был предложен в качестве механизма, приводящего к дисфункции GEC в патогенезе некоторых клубочковых заболеваний. Исторически изоляция ГЭС от моделей in vivo была, как известно, сложной задачей из-за трудностей в выделении чистых культур из клубочков. GEC имеют сложные требования к росту in vitro и очень ограниченную продолжительность жизни. Здесь мы описываем процедуру выделения и культивирования условно увековеченных ГЭС с флуоресцентными митохондриями, позволяющими отслеживать события деления и синтеза митохондрий. GEC были выделены из почек двойной трансгенной мыши, экспрессирующей термолабильный SV40 TAg (из Immortomouse), условно способствующий пролиферации и подавлению дифференцировки клеток, и фотоконвертируемый флуоресцентный белок (Dendra2) во всех митохондриях (от фотоактивируемых митохондрий [PhAMиссеченной] мыши). Полученная стабильная клеточная линия позволяет дифференцировать клетки после инактивации увековечивающего гена SV40 TAg и фотоактивации подмножества митохондрий, вызывая переключение флуоресценции с зеленого на красный. Использование mitoDendra2-GEC позволяет в реальном времени визуализировать события распределения, слияния и деления флуоресцентных митохондрий без окрашивания клеток.
Introduction
Клубочек имеет решающее значение для фильтрации крови, ограничивая прохождение крупных молекул через клубочковый фильтрационный барьер 1,2. Клубочек содержит четыре типа клеток: теменные эпителиальные клетки, подоциты (висцеральные эпителиальные клетки), клубочковые эндотелиальные клетки (GEC) и мезангиальные клетки3. Клубочковый эндотелий характеризуется уникальной сосудистой структурой, в соответствии с наличием фенестр, необходимых для больших объемов фильтрации4. Апикальная поверхность клубочкового эндотелия покрыта отрицательно заряженным слоем гликокаликса и оболочкой, называемой поверхностным слоем эндотелия, которая создает пространство между эндотелием и кровью. Эта структура обеспечивает высокую селективность заряда, ограничивая прохождение отрицательно заряженных молекул, таких как альбумин, и предотвращая адгезию лейкоцитов и тромбоцитов5.
ГЭС очень чувствительны к метаболическим изменениям, таким как гипергликемия, связанная с диабетической средой. Действительно, сахарный диабет приводит к усилению циркуляции вредных веществ, насыщению путей метаболизма глюкозы, нарушению клеточного окислительно-восстановительного баланса 3,6. Кроме того, увеличение активных форм кислорода вызывает митохондриальную дисфункцию, которая влияет на функцию эндотелия7.
Общей целью текущего протокола является выделение увековеченных клубочковых эндотелиальных клеток с флуоресцентными митохондриальными особенностями. Действительно, клеточная культура первичных ГЭС имеет ограниченный пролиферативный цикл и раннее старение8. Кроме того, наличие флуоресцентных митохондрий помогает исследовать события деления и слияния в ответ на гипергликемию или любое другое лечение. В качестве альтернативного метода другие лаборатории использовали h-TERT для увековечения клеток in vitro9.
Описанный здесь способ позволяет выделить условно увековеченные клубочковые эндотелиальные клетки mitoDendra2 у 4-6-недельных животных (рисунок 1). Этот подробный протокол описывает использование трансгенных мышей (H-2K b-tsA58), содержащих ген крупного опухолевого антигена обезьяны 40 (SV40 TAg)10,11 для генерации термолабильных условно увековеченных клеток. Продукт гена tsA58 TAg функционирует при разрешительной температуре 33 °C под контролем индуцируемого 5′-флангового промотора мышиного гена H-2Kb, который увеличивается выше базальных уровней при воздействии интерферона гамма (IFNγ), поэтому поддерживается условный фенотип пролиферации12. H-2Kb быстро деградирует при непермиссивной температуре 37 °C в отсутствие IFNγ, удаляя увековечивающую функцию tsA58Tag в клетках и позволяя клеткам развивать более дифференцированный фенотип 13,14,15. Необязательное скрещивание трансгенных мышей H-2Kb-tsA58 с мышами PhAM, которые экспрессируют митохондриально-специфическую (субъединицу VIII цитохром-с-оксидазы) Dendra2-green, позволяет вживую обнаружить флуоресцентные митохондрии16. Зеленая флуоресценция Dendra2 переключается на красную флуоресценцию после воздействия 405 нм лазера16. Когда митохондрии сливаются после переключения фотографий, они образуют вытянутые формы, которые кажутся желтыми от обмена зеленым и желтым материалом или кажутся красными, когда они подвергаются делению 7,17. MitoDendra2-GECs являются отличным инструментом для изучения клеточных реакций митохондрий GEC на различные стимулы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Митохондрии имеют решающее значение для клеточного метаболизма, гомеостаза и стрессовых реакций, и их дисфункция связана со многими заболеваниями, включая заболевания почек. Митохондрии играют роль в патологической генерации избыточных активных форм кислорода (АФК), регуляции внутри…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят профессора Сицзян Хэ и доктора Фу Цзя за их понимание изоляции эндотелиальных клеток мышей и благодарят профессора Моне Заиди за предоставлениеPhAM иссекенных мышей и ценные дискуссии. Авторы также хотели бы поблагодарить Microscopy CORE в Медицинской школе Икана на горе Синай и сотрудников за руководство, которое мы получили. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R01DK097253 и грантом МИНИСТЕРСТВА обороны CDMRP E01 W81XWH2010836 для I.S.D.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
