Şartlı Ölümsüzleştirilmiş Fare Glomerüler Endotel Hücrelerinin Floresan Mitokondri ile İzolasyonu
Summary
Makalede, termolabil simian virüsü 40’ı eksprese eden transgenik farelerin böbreklerinden şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerinin izole edilmesi ve foto-aktive edilebilir mitokondri, PhAMeksize edilmesi yöntemi açıklanmaktadır. Boncuklar, sindirim adımları, tohumlama ve GEC-CD31 pozitifin kültürlenmesi kullanılarak tüm böbreklerden glomerül izolasyonu prosedürünü açıklıyoruz.
Abstract
Glomerüler endotel hücresi (GEC) disfonksiyonu glomerüler filtrasyon bariyerinin parçalanmasını başlatabilir ve katkıda bulunabilir. Bazı glomerüler hastalıkların patogenezinde artmış mitokondriyal oksidatif stres, GEC disfonksiyonuna neden olan bir mekanizma olarak önerilmiştir. Tarihsel olarak, GEC’lerin in vivo modellerden izole edilmesi, saf kültürlerin glomerüllerden izole edilmesindeki zorluklar nedeniyle oldukça zor olmuştur. GEC’lerin in vitro karmaşık büyüme gereksinimleri ve çok sınırlı bir ömrü vardır. Burada, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş GEC’leri floresan mitokondri ile izole etme ve kültürleme prosedürünü açıklıyoruz, bu da mitokondriyal fisyon ve füzyon olaylarının izlenmesini sağlıyor. GEC’ler, termolabil SV40 TAg’yi (Immortomouse’tan) ifade eden, proliferasyonu şartlı olarak teşvik eden ve hücre farklılaşmasını baskılayan çift transgenik bir farenin böbreklerinden ve tüm mitokondrilerde foto-dönüştürülebilir bir floresan proteinden (foto-aktive edilebilir mitokondri [PhAMeksize edilmiş] fareden) izole edildi. Üretilen kararlı hücre hattı, ölümsüzleştirici SV40 TAg geninin inaktivasyonundan sonra hücre farklılaşmasına ve bir mitokondri alt kümesinin foto-aktivasyonuna izin verir ve floresanda yeşilden kırmızıya geçişe neden olur. MitoDendra2-GEC’lerin kullanımı, floresan mitokondrinin dağılımının, füzyonunun ve fisyon olaylarının hücreleri boyamadan canlı görüntülenmesini sağlar.
Introduction
Glomerulus, büyük moleküllerin glomerüler filtrasyon bariyeri 1,2’den geçişini kısıtlayarak kan filtrasyonu için kritik öneme sahiptir. Glomerulus dört hücre tipi içerir: parietal epitel hücreleri, podositler (viseral epitel hücreleri), glomerüler endotel hücreleri (GEC) ve mezangial hücreler3. Glomerüler endotel, büyük filtrasyon hacimleri için gerekli olan fenestra varlığına göre benzersiz bir vasküler yapı ile karakterizedir4. Glomerüler endotelin apikal yüzeyi, negatif yüklü bir glikokaliks tabakası ve endotel ile kan arasında bir boşluk yaratan endotel yüzey tabakası adı verilen bir kat ile kaplıdır. Bu yapı, albümin gibi negatif yüklü moleküllerin geçişini kısıtlayan, lökosit ve trombosit yapışmasını önleyen yüksek yüklü seçicilik sağlar5.
GEC’ler, diyabetik çevre ile ilişkili hiperglisemi gibi metabolik değişikliklere karşı çok hassastır. Gerçekten de, diyabet zararlı maddelerin dolaşımının artmasına, glikoz metabolizması yollarının doygunluğuna ve bozulmuş hücresel redoks dengesine yol açar 3,6. Ayrıca, reaktif oksijen türlerindeki artış, endotel fonksiyonunu etkileyen mitokondriyal disfonksiyona nedenolur 7.
Mevcut protokolün genel amacı, floresan mitokondriyal özelliklere sahip ölümsüzleştirilmiş glomerüler endotel hücrelerini izole etmektir. Gerçekten de, primer GEC’lerin hücre kültürü sınırlı bir proliferatif döngüye ve erken yaşlanmaya sahiptir8. Ek olarak, floresan mitokondrinin varlığı, hiperglisemi veya başka herhangi bir tedaviye yanıt olarak fisyon ve füzyon olaylarının incelenmesine yardımcı olur. Alternatif bir yöntem olarak, diğer laboratuvarlar in vitro9 hücrelerini ölümsüzleştirmek için h-TERT kullandılar.
Burada tarif edilen yöntem, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş mitoDendra2 glomerüler endotel hücrelerinin 4-6 haftalık hayvanlardan izole edilmesini sağlar (Şekil 1). Bu ayrıntılı protokol, termolabil şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş hücreler üretmek için simian virüsü 40 büyük tümör antijeni (SV40 TAg) geni10,11’i barındıran transgenik farelerin (H-2Kb-tsA58) kullanımını açıklar. tsA58 TAg gen ürünü, fare H-2Kb geninin indüklenebilir 5′ yan promotörünün kontrolü altında 33 ° C’lik izin verilen sıcaklıkta işlevseldir, bu da interferon gamaya (IFNγ) maruz kalındığında bazal seviyelerin üzerine çıkarılır, bu nedenle koşullu proliferasyon fenotip12’yi korur. H-2K b, IFNγ’nun yokluğunda izin verilmeyen 37 ° C’lik sıcaklıkta hızla parçalanır, tsA58Tag’in hücrelerdeki ölümsüzleştirme işlevini ortadan kaldırır ve hücrelerin daha farklılaşmış bir fenotip13,14,15 geliştirmesine izin verir. H-2Kb-tsA58 transgenik farelerin, mitokondriye özgü (sitokrom c oksidazın alt birimi VIII) Dendra2-yeşilini ifade eden PhAM fareleri ile isteğe bağlı geçişi, floresan mitokondri16’nın canlı tespitine izin verir. Dendra2 yeşil floresan, 405 nm lazer16’ya maruz kaldıktan sonra kırmızı floresana geçer. Mitokondri foto-anahtarlamadan sonra kaynaştığında, yeşil ve sarı malzemenin değişiminden sarı görünen veya fisyona uğradıklarında kırmızı görünen uzun şekiller oluştururlar 7,17. MitoDendra2-GEC’ler, GEC mitokondrisinin farklı uyaranlara hücresel tepkilerini incelemek için harika bir araçtır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondri, hücresel metabolizma, homeostaz ve stres yanıtları için kritik öneme sahiptir ve işlev bozuklukları böbrek hastalığı da dahil olmak üzere birçok hastalıkla bağlantılıdır. Mitokondri, aşırı reaktif oksijen türlerinin (ROS) patolojik oluşumunda, hücre içi kalsiyum düzeylerinin düzenlenmesinde, hücre ölüm yolaklarında ve sitoiskelet dinamiklerinde rol oynamaktadır21,22,23.
<p class="j…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, farelerin endotel hücre izolasyonu konusundaki görüşleri için Profesör Cijiang He ve Dr. Fu Jia’ya teşekkür ediyor ve PhAMeksize edilmiş fareleri ve değerli tartışmaları sağladığı için Profesör Mone Zaidi’ye teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca, Sina Dağı’ndaki Icahn Tıp Fakültesi’ndeki Mikroskopi CORE’a ve aldığımız rehberlik için personele teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R01DK097253 ve Savunma Bakanlığı CDMRP hibesi E01 W81XWH2010836’dan I.S.D.’ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
