Eine empfindliche visuelle Methode zum Nachweis von Schwefelwasserstoff produzierenden Bakterien
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Schwefelwasserstoff produzierenden Bakterien mit einem modifizierten Protokoll vor, das für die Wismutsulfid (BS)-Fällung verwendet wird. Die Hauptvorteile dieser Methode sind, dass sie einfach zu bewerten ist und keine spezielle Ausrüstung erfordert.
Abstract
Schwefelwasserstoff (H2S) ist ein giftiges Gas, das von Bakterien bei der Proteolyse schwefelhaltiger Aminosäuren und Proteine produziert wird und eine wichtige Rolle für die menschliche Gesundheit spielt. DerH2S-Produktionstestist einer der wichtigsten bakteriellen biochemischen Identifikationstests. Die traditionellen Methoden sind nicht nur mühsam und zeitaufwändig, sondern neigen auch dazu, das Bakterienwachstum aufgrund der toxischen Wirkung von Schwermetallsalzen in schwefelhaltigen Medien zu hemmen, was oft zu negativen Ergebnissen führt. Hier haben wir eine einfache und sensitive Methode etabliert, umH2Sin Bakterien nachzuweisen. Bei dieser Methode handelt es sich um eine modifizierte Version der Wismutsulfid (BS)-Fällung, bei der transparente 96-Well-Mikrotiterplatten verwendet werden. Die Bakterienkultur wurde mit einer L-Cysteinhaltigen Wismutlösung kombiniert und 20 min lang kultiviert, an deren Ende ein schwarzer Niederschlag beobachtet wurde. Die visuelle Nachweisgrenze für H 2 S lag bei0,2mM. Anhand des visuellen Farbwechsels kann eine einfache, durchsatzreiche und schnelle Detektion vonH2S-produzierendenBakterien erreicht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit dieser Methode dieH2S-Produktionin Bakterien nachgewiesen werden kann.
Introduction
Schwefelwasserstoff produzierende Bakterien können schwefelhaltige Aminosäuren und Proteine nutzen, um Schwefelwasserstoff (H2S) herzustellen. Die Produktion vonH2Serfolgt in der Regel in gramnegativen Bakterien der Familie der Enterobacteriaceae sowie in Mitgliedern von Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. und Shewanella spp.1. Diese Bakterien haben die Fähigkeit, Sulfat zu Schwefelwasserstoff (H2S) zu reduzieren, um Energie zu gewinnen. Schwefelwasserstoff wird mit der Entwicklung bakterieller Arzneimittelresistenzen in Verbindung gebracht. H2Sschützt Bakterien vor der Toxizität reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und wirkt so der antibakteriellen Wirkung von Antibiotika entgegen 2,3. H2Shat auch eine wichtige physiologische Wirkung bei der Aufrechterhaltung der Homöostase. Auf supraphysiologischer Ebene hat sichH2Sals hochgradig toxisch für den Körper erwiesen. Im menschlichen Körper hatH2Seine weitere Rolle als gasförmiges Signalmolekül, das an einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt ist. H2Skann die systolische Funktion des Herzens regulieren und spielt eine wichtige physiologische Rolle bei der Entspannung der Blutgefäße, der Hemmung des Gefäßumbaus und dem Schutz des Myokards 4,5. H2Sspielt auch eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Nervensystems und des Verdauungstraktes 6,7. Es wurde festgestellt, dass Bakterien, wenn sie bakteriziden Antibiotika ausgesetzt sind, tödliche reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produzieren, die zum Zelltod führen 8,9,10,11.
Als gängiger biochemischer Test in mikrobiologischen Laborkursen ist der Schwefelwasserstofftest ein wichtiges Experiment zur Identifizierung von Bakterien, insbesondere Bakterien der Familie Enterobacteriaceae. Derzeit wird der Schwefelwasserstofftest in der Regel an einer Vielzahl von schwefelhaltigen Aminosäuren und Bleiacetatmedium durchgeführt, die mit den zu testenden Bakterien beimpft sind. Nach einer Inkubationszeit (2-3 Tage) werden die Ergebnisse beurteilt, indem beobachtet wird, ob das Nährmedium oder der Bleiacetat-Papierstreifen aufgrund der Bleiacetatproduktion geschwärzt ist11. Diese traditionellen Methoden sind jedoch nicht nur mühsam und zeitaufwändig, sondern neigen auch dazu, das Bakterienwachstum aufgrund der toxischen Wirkung von Schwermetallsalzen in schwefelhaltigen Medien zu hemmen, was oft zu negativen Ergebnissen führt. Für den Nachweis von H2S12,13 wurde ein Wismut-basiertes Verfahren etabliert. H2Skann mit Wismut reagieren und schwarze Wismutsulfidausfällung bilden. Um eine Reform für diesen biochemischen Test durchzuführen, muss eine einfache und schnelle Methode ohne Nebenwirkungen auf das Bakterienwachstum etabliert werden. Hier haben wir eine einfache Methode zum Nachweis von Schwefelwasserstoff produzierenden Bakterien entwickelt, die in einer in vitro Umgebung unter Verwendung von Wismutsulfid als Substrat de einem 96-Well-Mikrotiterplattenformat gezüchtet wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Schwefelwasserstoffproduktionstest ist einer der konventionellen phänotypischen Tests zur Identifizierung und Differenzierung von Bakterienstämmen. Viele Bakterienarten können in ihrer natürlichen Umgebung, wie z. B. Wasser, Schwefelwasserstoff produzieren. Zu diesen Bakterienarten gehören Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., einige Stämme von Klebsiella sp., Escherichia coli und einige Arten von anaeroben Clostridien<sup class="xre…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch das Priority Academic Program Development der Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) und das Teaching Reform Research Project der China Pharmaceutical University (2019XJYB18) unterstützt.
Materials
| Bismuth (III)chloride | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | 7787-60-2 | |
| EDTA | Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd | 60-00-4 | |
| Enterococcus faecalis | ATCC | 19433 | |
| Fusobacterium nucleatum | ATCC | 25586 | |
| Klebsiella pneumoniae | ATCC | 43816 | |
| L-cysteine | Amresco | 52-90-4 | |
| Proteus vuigaris | CMCC | 49027 | |
| Salmonella paratyphi A | CMCC | 50001 | |
| Salmonella paratyphi B | CMCC | 50094 | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 | |
| Triethanolamine-HCl | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. | 637-39-8 |
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