قياس انضغاط الخلية والنواة على أساس المجهر الصوتي
Summary
هنا يتم تقديم بروتوكول لبناء نظام سريع وغير مدمر لقياس انضغاط الخلية أو النواة على أساس microdevice المائع الصوتي. تم التحقيق في التغيرات في الخواص الميكانيكية للخلايا السرطانية بعد الانتقال الظهاري الوسيط أو الإشعاع المؤين ، مما يدل على احتمال تطبيق هذه الطريقة في البحث العلمي والممارسة السريرية.
Abstract
تلعب ميكانيكا الخلايا دورا مهما في ورم خبيث في ورم خبيث للخلايا والحساسية الإشعاعية. خلال هذه العمليات ، غالبا ما تكون دراسة الخواص الميكانيكية للخلايا صعبة. طرق القياس التقليدية القائمة على التلامس مثل الضغط أو التمدد عرضة للتسبب في تلف الخلايا ، مما يؤثر على دقة القياس وزراعة الخلايا اللاحقة. يمكن أن تؤثر القياسات في حالة الالتصاق أيضا على الدقة ، خاصة بعد التشعيع لأن الإشعاع المؤين سوف يسطيح الخلايا ويعزز الالتصاق. هنا ، تم تطوير نظام قياس ميكانيكا الخلايا على أساس طريقة الموائع الصوتية. يمكن الحصول على انضغاط الخلية عن طريق تسجيل مسار حركة الخلية تحت تأثير القوة الصوتية ، والتي يمكنها تحقيق قياس سريع وغير مدمر في الحالة المعلقة. تقدم هذه الورقة تقريرا مفصلا عن بروتوكولات تصميم الرقاقة وإعداد العينات وتسجيل المسار واستخراج المعلمات وتحليلها. تم قياس انضغاط أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية بناء على هذه الطريقة. كما تم قياس انضغاط النواة عن طريق ضبط تردد الرنين للسيراميك الكهرضغطي وعرض القناة الدقيقة. جنبا إلى جنب مع التحقق من المستوى الجزيئي لتجارب التألق المناعي ، تمت مقارنة انضغاط الخلايا قبل وبعد الانتقال الظهاري الناجم عن الدواء إلى الانتقال الوسيط (EMT). علاوة على ذلك ، تم الكشف عن تغيير انضغاط الخلايا بعد تشعيع الأشعة السينية بجرعات مختلفة. طريقة قياس ميكانيكا الخلايا المقترحة في هذه الورقة عالمية ومرنة ولها آفاق تطبيق واسعة في البحث العلمي والممارسة السريرية.
Introduction
تلعب الخواص الميكانيكية للخلايا دورا مهما في ورم خبيث في ورم خبيث للخلايا والحساسية الإشعاعية 1,2. للحصول على فهم متعمق لدور الخواص الميكانيكية للخلية في العملية المذكورة أعلاه ، يعد القياس الدقيق للميكانيكا الخلوية أمرا بالغ الأهمية ، ويجب ألا يتسبب القياس في تلف الخلايا للزراعة والتحليل اللاحقين. يجب أن تكون عملية القياس في أسرع وقت ممكن ، وإلا فقد تتأثر صلاحية الخلية إذا تمت إزالة الخلايا من بيئة الزراعة لفترة طويلة.
تواجه طرق قياس ميكانيكا الخلايا الحالية بعض القيود. بعض الطرق ، مثل قياس الخلايا الملتوية المغناطيسي ، والملقط المغناطيسي ، وعلم الميكروريولوجيا لتتبع الجسيمات ، تسبب تلف الخلايا بسبب إدخال الجسيمات في الخلايا3،4،5. الطرق التي تقيس عن طريق الاتصال بالخلايا ، مثل مجهر القوة الذرية (AFM) ، وشفط الماصة الدقيقة ، والانقباض الدقيق ، وتقنية اللوحة المتوازية ، هي أيضا عرضة لتلف الخلايا ومن الصعب زيادة الإنتاجية6،7،8. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الإشعاع المؤين سوف يسطيح الخلايا ويزيد من التصاقها9 ؛ لذلك من الضروري قياس ميكانيكا الخلايا بأكملها في التعليق.
استجابة للتحديات المذكورة أعلاه ، تم تطوير نظام قياس ميكانيكا الخلايا على أساس طريقة الموائع الصوتية10،11،12،13،14. يتطابق عرض القناة مع نصف الطول الموجي الصوتي ، مما يخلق عقدة موجة دائمة عند خط الوسط للقناة الدقيقة. تحت تأثير قوة الإشعاع الصوتي ، يمكن للخلايا أو الخرز القياسي الانتقال إلى عقدة الضغط الصوتي. نظرا لأن الخصائص الفيزيائية للخرز القياسي (الحجم والكثافة وقابلية الانضغاط) معروفة ، يمكن تحديد كثافة الطاقة الصوتية. بعد ذلك ، يمكن الحصول على انضغاط الخلايا عن طريق تسجيل مسارات حركة الخلايا في المجال الصوتي. يمكن تحقيق قياس عالي الإنتاجية غير مدمر للخلايا في حالة التعليق. ستقدم هذه الورقة تصميم رقاقة الموائع الدقيقة وإنشاء النظام وخطوات القياس. تم إجراء قياس أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية للتحقق من دقة الطريقة. تم توسيع نطاق تطبيق هذه الطريقة ليشمل الهياكل دون الخلوية (مثل النواة) عن طريق ضبط تردد الرنين للسيراميك الكهرضغطي وعرض القناة الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقيق في التغيرات في انضغاط الخلايا بعد EMT الناجم عن الدواء أو تشعيع الأشعة السينية بجرعات مختلفة. تظهر النتائج قابلية التطبيق الواسعة لهذه الطريقة كأداة قوية لدراسة العلاقة بين التغيرات الكيميائية الحيوية والخواص الميكانيكية الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
طرق قياس ميكانيكا الخلايا شائعة الاستخدام هي AFM ، وشفط الماصة الدقيقة ، وطرق الموائع الدقيقة ، وتقنية اللوحة المتوازية ، والملقط البصري ، والنقالة البصرية ، والطرق الصوتية20. يمكن أن تعمل طرق الموائع الدقيقة مع ثلاثة طرق: الانقباض الجزئي ، والتدفق الممتد ، وتدفق القص. من بينها …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (أرقام المنح 12075330 و U1932165) ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ ، الصين (رقم المنحة 2020A1515010270).
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
References
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Frame, F. M., et al. HDAC inhibitor confers radiosensitivity to prostate stem-like cells. British Journal of Cancer. 109 (12), 3023-3033 (2013).
- Tseng, Y., Kole, T. P., Wirtz, D. Micromechanical mapping of live cells by multiple-particle-tracking microrheology. Biophysical Journal. 83 (6), 3162-3176 (2002).
- Möller, W., Brown, D. M., Kreyling, W. G., Stone, V. Ultrafine particles cause cytoskeletal dysfunctions in macrophages: role of intracellular calcium. Particle and Fibre Toxicology. 2, 7 (2005).
- Wang, X., et al. A three-dimensional magnetic tweezer system for intraembryonic navigation and measurement. IEEE Transactions on Robotics. 34 (1), 240-247 (2018).
- Machida, S., et al. Direct manipulation of intracellular stress fibres using a hook-shaped AFM probe. Nanotechnology. 21 (38), 385102 (2010).
- Bufi, N., et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Jung, J. -. W., et al. Ionising radiation induces changes associated with epithelial-mesenchymal transdifferentiation and increased cell motility of A549 lung epithelial cells. European Journal of Cancer. 43 (7), 1214-1224 (2007).
- Hartono, D., et al. On-chip measurements of cell compressibility via acoustic radiation. Lab-on-a-Chip. 11 (23), 4072-4080 (2011).
- Sitters, G., et al. Acoustic force spectroscopy. Nature Methods. 12 (1), 47-50 (2015).
- Augustsson, P., Karlsen, J. T., Su, H. -. W., Bruus, H., Voldman, J. Iso-acoustic focusing of cells for size-insensitive acousto-mechanical phenotyping. Nature Communications. 7 (1), 11556 (2016).
- Cushing, K. W., et al. Ultrasound characterization of microbead and cell suspensions by speed of sound measurements of neutrally buoyant samples. Analytical Chemistry. 89 (17), 8917-8923 (2017).
- Riaud, A., Wang, W., Thai, A. L. P., Taly, V. Mechanical characterization of cells and microspheres sorted by acoustophoresis with in-line resistive pulse sensing. Physical Review Applied. 13 (3), 034058 (2020).
- Petersson, F., Aberg, L., Swärd-Nilsson, A. -. M., Free Laurell, T. flow acoustophoresis: microfluidic-based mode of particle and cell separation. Analytical Chemistry. 79 (14), 5117-5123 (2007).
- Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zänker, K. S. An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood. Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).
- Katholnig, K., Poglitsch, M., Hengstschläger, M., Weichhart, T. Lysis gradient centrifugation: a flexible method for the isolation of nuclei from primary cells. Methods in Molecular Biology. 1228, 15-23 (2015).
- Fu, Q., Zhang, Y., Huang, T., Liang, Y., Liu, Y. Measurement of cell compressibility changes during epithelial-mesenchymal transition based on acoustofluidic microdevice. Biomicrofluidics. 15 (6), 064101 (2021).
- Zhang, Y., et al. Ionizing radiation-induced DNA damage responses affect cell compressibility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 603, 116-122 (2022).
- Hao, Y., et al. Mechanical properties of single cells: Measurement methods and applications. Biotechnology Advances. 45, 107648 (2020).
- Yousafzai, M., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. Journal of Biomedical Optics. 21 (5), 057004 (2016).
- Wei, M. -. T., et al. A comparative study of living cell micromechanical properties by oscillatory optical tweezers. Optics Express. 16 (12), 8594-8603 (2008).
- Khan, Z. S., Vanapalli, S. A. Probing the mechanical properties of brain cancer cells using a microfluidic cell squeezer device. Biomicrofluidics. 7 (1), 011806 (2013).
- Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins. Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).
- Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).
- Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).
