Messung der Kompressibilität von Zelle und Zellkern mittels akustofluidischem Mikrogerät
Summary
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um ein schnelles und zerstörungsfreies System zur Messung der Zell- oder Kernkompressibilität basierend auf akustofluidischen Mikrogeräten aufzubauen. Veränderungen der mechanischen Eigenschaften von Tumorzellen nach epithelial-mesenchymalem Übergang oder ionisierender Strahlung wurden untersucht, was die Anwendungsperspektive dieser Methode in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Praxis aufzeigt.
Abstract
Die Zellmechanik spielt eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung, der malignen Transformation von Zellen und der Strahlenempfindlichkeit. Während dieser Prozesse ist die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften der Zellen oft eine Herausforderung. Konventionelle Messmethoden, die auf Kontakt basieren, wie Kompression oder Dehnung, neigen dazu, Zellschäden zu verursachen, was die Messgenauigkeit und die anschließende Zellkultur beeinträchtigt. Messungen im adhärenten Zustand können auch die Genauigkeit beeinträchtigen, insbesondere nach der Bestrahlung, da ionisierende Strahlung Zellen abflacht und die Adhäsion verbessert. Hier wurde ein zellmechanisches Messsystem entwickelt, das auf einer akustofluidischen Methode basiert. Die Zellkompressibilität kann durch Aufzeichnung der Zellbewegungsbahn unter Einwirkung der akustischen Kraft erreicht werden, wodurch eine schnelle und zerstörungsfreie Messung im suspendierten Zustand realisiert werden kann. In diesem Artikel werden die Protokolle für Chipdesign, Probenvorbereitung, Trajektorienaufzeichnung, Parameterextraktion und -analyse ausführlich beschrieben. Anhand dieser Methode wurde die Kompressibilität verschiedener Tumorzelltypen gemessen. Die Messung der Kompressibilität des Kerns wurde ebenfalls durch Anpassung der Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik und der Breite des Mikrokanals erreicht. In Kombination mit der molekularen Verifikation von Immunfluoreszenzexperimenten wurde die Zellkompressibilität vor und nach dem medikamenteninduzierten epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT) verglichen. Weiterhin wurde die Veränderung der Zellkompressibilität nach Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen aufgedeckt. Die in dieser Arbeit vorgeschlagene zellmechanische Messmethode ist universell und flexibel und hat breite Anwendungsperspektiven in der wissenschaftlichen Forschung und klinischen Praxis.
Introduction
Zellmechanische Eigenschaften spielen eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung, der malignen Transformation von Zellen und der Strahlenempfindlichkeit 1,2. Um ein tiefes Verständnis der Rolle der zellmechanischen Eigenschaften in dem oben genannten Prozess zu erlangen, ist eine genaue Messung der Zellmechanik von entscheidender Bedeutung, und die Messung sollte keine Schäden an den Zellen für die anschließende Kultur und Analyse verursachen. Der Messprozess sollte so schnell wie möglich sein, da sonst die Zelllebensfähigkeit beeinträchtigt werden kann, wenn Zellen für längere Zeit aus der Kultivierungsumgebung entfernt werden.
Bestehende zellmechanische Messmethoden stoßen auf einige Einschränkungen. Einige Methoden, wie die magnetische Drehzytometrie, die Magnetpinzette und die Partikelverfolgungsmikrorheologie, verursachen Zellschäden durch die Einführung von Partikeln in Zellen 3,4,5. Methoden, die durch Kontakt mit Zellen messen, wie Rasterkraftmikroskop (AFM), Mikropipettenaspiration, Mikrokonstriktion und Parallelplattentechnik, sind ebenfalls anfällig für Zellschäden und der Durchsatz ist schwer zu erhöhen 6,7,8. Darüber hinaus wird ionisierende Strahlung Zellen abflachen und ihre Adhäsion erhöhen9; Es ist daher notwendig, die Ganzzellmechanik in Suspension zu messen.
Als Antwort auf die oben genannten Herausforderungen wurde ein zellmechanisches Messsystem entwickelt, das auf der akustofluidischen Methode 10,11,12,13,14 basiert. Die Kanalbreite ist auf die akustische Halbwellenlänge abgestimmt, wodurch ein stehender Wellenknoten an der Mittellinie des Mikrokanals entsteht. Unter Einwirkung der akustischen Strahlungskraft können sich die Zellen oder Standardperlen zum akustischen Druckknoten bewegen. Da die physikalischen Eigenschaften der Standardkügelchen (Größe, Dichte und Kompressibilität) bekannt sind, kann die akustische Energiedichte bestimmt werden. Dann kann die Zellkompressibilität durch Aufzeichnung der Bewegungsbahnen von Zellen im akustischen Feld erhalten werden. Eine zerstörungsfreie Hochdurchsatzmessung von Zellen im Suspensionszustand kann erreicht werden. In diesem Beitrag werden das Design des mikrofluidischen Chips, der Aufbau des Systems und die Messschritte vorgestellt. Es wurden verschiedene Arten von Tumorzellen gemessen, um die Genauigkeit der Methode zu überprüfen. Der Anwendungsbereich dieser Methode wurde durch Anpassung der Resonanzfrequenz der piezoelektrischen Keramik und der Breite des Mikrokanals auf subzelluläre Strukturen (z.B. Kern) erweitert. Darüber hinaus wurden die Veränderungen der Zellkompressibilität nach medikamenteninduzierter EMT- oder Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen untersucht. Die Ergebnisse zeigen die breite Anwendbarkeit dieser Methode als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Korrelation zwischen biochemischen Veränderungen und zellulären mechanischen Eigenschaften.
Protocol
Representative Results
Discussion
Häufig verwendete zellmechanische Messmethoden sind AFM, Mikropipettenaspiration, mikrofluidische Methoden, Parallelplattentechnik, optische Pinzette, optische Trage und akustische Methoden20. Mikrofluidik-Methoden können mit drei Ansätzen arbeiten: Mikroverengung, Dehnströmung und Scherströmung. Unter ihnen sind optische Stretcher, optische Pinzetten, akustische Methoden, Dehnströmung und Scherströmungsansätze berührungslose Messungen. Im Gegensatz zu Kontaktmessungen können berührungs…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Förderkennzeichen 12075330 und U1932165) und der Natural Science Foundation der Provinz Guangdong, China (Förderkennzeichen 2020A1515010270) unterstützt.
Materials
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
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